《骨髓间充质干细胞治疗慢性特发性血小板减少性紫癜的体外研究1)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓间充质干细胞治疗慢性特发性血小板减少性紫癜的体外研究1)（49页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、福建医科大学 硕士学位论文 骨髓间充质干细胞治疗慢性特发性血小板减少性紫癜的体外研 究 姓名：危永基 申请学位级别：硕士 专业：内科学（血液病学） 指导教师：林艳娟 20100401 骨髓间充质干细胞治疗慢性特发性血小板减少性紫癜的体外研究 中文摘要 目的体外探讨同种异体骨髓间充质干细胞( b o n em a r r o w m e s e n c h y m a ls t e mc e l l ，B M M S C s ) 用于治疗慢性特发性血小板减少性紫癜( c h r o m c i d i o p a t h i ct h r o m b o c y t o p e n i cp u
2、 r p u r a , c l T P ) 的可行性。 方法1 正常人B M M S C s 的分离、扩增；倒置显微镜下观察B M M S C s 的细胞形态和生长特性。2 c l T P 患者外周血单个核细胞( p e r i p h e r a lb l o o d m o n o n u c l e a rc e l l s ，P B M N C s ) 的分离、纯化与培养。3 同种异体B M M S C s 与经美洲商陆刺激的c I T P 患者P B M N C s 细胞共培养，用M T T 法检测共培 养前后淋巴细胞增殖能力的变化；通过流式细胞仪检测各组淋巴细胞中 C D19 +
3、 C D 5 + B1 淋巴细胞比例的变化；E L I S A 法检测各组细胞培养上清液 中P A I g G 的含量。4 在正常人骨髓巨核祖细胞集落培养体系中分别加入 5 0 、2 5 或不加骨髓间充质干细胞培养上清( B M M S C s L C M ) ，通过 计数各组C F U M K 的个数，观察B M M S C s L C M 在体外对正常人骨髓巨 核祖细胞集落形成的影响。 结果1 正常人的骨髓M S C s 呈梭形贴壁生长，能在体外连续传代，能 冷冻保存；2 、与对照组相比，与B M M S C s 共培养的c l T P 患者P B M N C s 中淋巴细胞的增殖能力被显
4、著抑制( P 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构( 如国家图书馆、中国学术期刊电子杂志社 的中国优秀博硕士学位论文数据库、中国科学技术信息研究所的中国 学位论文全文数据库等) 送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权福建医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 作者签名( 手写) 年多月t ，7 日 导师签名( 手写) ：描拦嚣 护l o 。 年月盟日 够狙群业 ：
5、o 一 ) 一 写 年 手 一 名 乞一 雠 生 臌 丝 导 JL 刖舌 间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，是一群中胚层来源的具有 自我更新及多向分化潜能的多能干细胞。M S C s 最初在骨髓中被发现，因 其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控( 诱导免疫 耐受) 和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内 或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、 神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具 有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官 损伤修复。间充质干细胞表面C D10 5 、C D16
6、 6 、C D 7 3 的阳性表达，而不 表达C D 31 、C D 3 4 、C D 4 5 、C D14 及其贴壁生长的性质使目前对间充质干 细胞分离、纯化、体外培养成为现实1 。 M S C s 不表达H L A I I 类分子和F a s l ，也不表达共刺激分子B 7 1 、 B 7 2 ，低水平表达或不表达H L A I 类分子、C D 4 0 和C D 4 0 L 。将间充质 干细胞与异基因P B M N C s 或同种异体T 淋巴细胞共培养后不能引起同种 异体T 淋巴细胞显著增殖，说明M S C s 具有低免疫源性和较低的抗原提呈 能力。而且分化与未分化的间充质干细胞都不诱导同
7、种异体T 淋巴细胞的 增殖反应，此外都具有调节免疫反应的能力2 3 4 钉。而且体外实验证明 M S C s 能抑制B 细胞抗体的生成哺5 。M S C s 的低免疫源性可以使其逃逸 T 淋巴细胞和N K 细胞的识别而在异体甚至异种体内长期存活，同时，M S C s 有可能诱导对同肿异体供者来源的组织器官的耐受而减轻移植后G V H D 的发生，在器官移植方面有很好的临床应用价值。M S C s 的另一重要应用 是其免疫调节功能在治疗自身免疫性疾病中的应用，在动物和人身上已有 相当多的研究报道，已成为当今一大热门研究领域。 I T P 即特发性血小板减少性紫癜是血液系统一种常见的疾病，约占出
8、血性疾病总数的30 ，分为急性型和慢性型，急性型在治愈后约有三分之 一复发转为慢性型。I T P 首选糖皮质激素，但临床上有不少病例对激素反 应差甚至无反应。慢性型常因感染而加重，严重时常危及生命，病情迁延 8 不愈无法彻底根治，对于慢性难治性病例可考虑脾切除和免疫抑制，但这 些手段都具有严重的副作用，给病人经济上和生活上带来巨大痛苦，因此 寻找新的有效地治疗c l T P 的方法日益迫切。 I T P 的病因迄今不明。现在已知道的发病相关因素有感染、免疫因 素、肝脾的作用、遗传因素及其他因素如雌激素等。免疫异常是I T P 发病 最重要的原因，最近的研究表明I T P 不但有体液免疫异常而且
9、有细胞免疫 异常，如细胞免疫方面存在T h l 和T h 0 极化现象伴I L 2 及I F N 。Y 分泌水 平增多、C D 4 + C D 2 5 + T r e g 细胞在发病期间显著减少等现象；体液免疫方 面出现血小板相关抗体( P A I g ，8 0 以上的I T P 患者血小板表面可检测到 P A I g 多为I g G 。) 、产P A I g 的B 细胞寡克隆增生、C D 19 + C D 5 + B1 细胞 在发病期间显著增多等异常表现7 、8 9 1 0 11 1 2 1 ”。各种机制导致自身 反应性T 、B 淋巴细胞激活、增殖，自身反应性B 淋巴细胞分泌血小板抗 体，通
10、过各种机制破坏血小板及影响巨核细胞的发育而导致外周血血小板 数量减少。 根据细胞表面是否表达C D 5 ，可将B 细胞分为B1 ( C D 5 + ) 细胞和 B 2 ( C D 5 1 细胞两个亚群。B1 细胞主要定居于腹腔、胸腔以及肠壁的固有 层，正常人外周血含量很少。最近的研究表明B1 细胞能产生多种针对自 身抗原( 如变性红细胞、I G 、s s D N A 等) 的抗体，与自身免疫病有密切关 系钔。M i z u t a n iH 等发现特发性血小板减少性紫癜( I T P ) 患者外周血 及脾脏C D 5 + B 细胞水平显著增高，C D 5 + B 细胞体外培养时 可产生一定量的
11、PA Ig ，提示C D 5 + B 细胞与ITP 的发病机制有关。 吕宝君、侯明等研究表明脾脏C D 5 + B 细胞和C D 5 一B 细胞共同参与了PA I g 的产生1 扪。且A r i t aM 等研究表明C D 5 + B 细胞比C D 5 一B 细胞产生血 小板相关抗体的能力强钉，可见B1 细胞的增多与I T P 的发病有密切关 系。和同种异体B M M S C s 共培养后，我们可通过检测共培养前后c l T P 患 者P B M N C s 中C D19 C D 5 + B1 细胞比例的变化及B 淋巴细胞所分泌得P A I g G 的量来判断B M M S C s 对c l
12、T P 患者免疫异常的免疫调节功能。 美洲商陆( P W M ) 是对T 、B 细胞的增殖均有非特异性刺激作用的有丝 分裂原( 5l ag m 1 ) 1 6 1 7 副，可用于体外细胞免疫和体液免疫功能的检 9 测。所以我们可以通过a l l o B M M S C s 与经P W M 刺激的e l T P 患者P B M N C s 共培养，观察a l l o B M M S C s 对C I T P 患者外周血淋巴细胞增殖，B 淋巴细 胞亚群( C D19 C D 5 + B1 细胞) 及功能异常( 分泌P A I g G ) 的调节作用，从 而为B M M S C s 用于e l T
13、P 的临床治疗提供实验依据。 C F U M K 是分化的巨核祖细胞，形成有一个增殖中心的纯巨核细胞 集落，细胞数多在3 2 0 之间。C F U M K 是体外培养最容易观察到的 巨核祖细胞，在骨髓巨核祖细胞中占9 0 以上，免疫标志为C D 3 + 4 、C D 41 + 、 H L A D R + n8 1 。我们采用甲基纤维素半固体培养体系培养C F U M K n 9 、2 0 l ， 再原有的培养体系中加入B M M S C s 培养上清，观察B M M S C s 培养上清 对正常人骨髓巨核祖细胞集落形成单位( C F U M K ) 的影响，以探讨输注 B M M S C s
14、后对受者骨髓巨核细胞生成所产生的影响。 J 0 第一部分 同种异体骨髓间充质干细胞对e l T P 患者外周血B 淋巴细胞亚群 及其功能的调节 材料与方法 一、材料： 1 1 标本来源： 福建医科大学附属协和医院正常骨髓捐献者( 18 4 5 岁，均知情同意) ： 福建医科大学附属协和医院血液科门诊及住院c l T P 患者外周血，诊断标 准参考张之南【2 1 】等血液病诊断及疗效标准( 第3 版) 1 2 主要试剂： 人淋巴细胞分离液( 比重1 0 7 7 9 m 1 )天津T B D 公司 胎牛血清Hyclone公司 025胰酶Hyclone公司 L G D M E M F 1 2G i
15、b c o 公司 16 4 0 粉术G i b c o 公司 P W M美洲商陆 M M C丝裂霉素 二甲基亚砜( D M S O )上海金山亭新化工试剂厂 C D 4 5 P e r C PB D 公司 鼠抗人C D l 9 P EB D 公司 鼠抗人C D 5 F I T CB D 公司 N a H C 0 3上海试剂一厂 N a C l汕头市西陇化工厂 K C l汕头市金砂化工厂 K H 2 P 0 4汕头市金砂化工厂 N a 2 H P 0 4 12 H 2 0上海试剂一厂 台盼兰 异丙醇 无水乙醇 焦碳酸二乙酯( D E P C ) 乙二胺四乙酸二钠( E D T A ) 1 3 主
16、要仪器： 5 0 m l 塑料培养瓶 2 4 孔板 10 0 m l 玻璃瓶 超净工作台 水平离心机 低温离心机 细胞培养箱 光学显微镜 倒置显微镜 流式细胞仪 电子天平 8 0 冰箱 移液枪 1 4 主要试剂的配制： S i g m a 公司 上海试一化学试剂有限公司 上海振兴化工一厂 A m r e s c o 公司 上海青析化工科技有限公司 C o r n i n g 公司 C o r n i n g 公司 江苏海门市塑料制品厂 苏州净化设备有限公司 T h e r m o ，U S A J 2 21 型，B e c k m a n 公司 H e a lF o r c e 公司 O l y m P u s 公司 O l y m P u s 公司 F A C S c a n B D 公司 O h a u s 公司 T h e r m o ，U S A 德国E p p e n d o r
