《骨髓间充质干细胞对重症急性胰腺炎大鼠损伤胰腺的组织修复作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《骨髓间充质干细胞对重症急性胰腺炎大鼠损伤胰腺的组织修复作用（89页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二军医大学 硕士学位论文 骨髓间充质干细胞对重症急性胰腺炎大鼠损伤胰腺的组织修复 作用 姓名：陆奕 申请学位级别：硕士 专业：内科学（消化系病） 指导教师：李兆申;高军 20100501 骨髓间充质干细胞对重症急性胰腺炎大鼠损伤胰腺的组织修复作用 骨髓间充质干细胞对重症急性 胰腺炎大鼠损伤胰腺的组织修复作用 捅斐 急性胰腺炎是常见急腹症之一，其中约1 0 2 0 的患者可发展为重症急性胰腺炎 ( S e v e r eA c u t eP a n c r e a t i t i s ，S A P ) 。S A P 发病凶险，预后差，临床死亡率高。目前， 临床上对S A P 的治疗仍以抑制胰酶
2、分泌和合成，预防性应用抗生素和营养支持等保 守治疗为主，缺乏特异有效的治疗方法。据报道，骨髓间充质干细胞( M e s e n c h y m a l S t e mC e l l s ，M S C s ) 参与了急性胰腺炎的发病过程，动员M S C s 可减轻S A P 病情， 改善其预后。本课题以S A P 大鼠模型为研究对象，给予S A P 雌性模型大鼠输注同种 属雄性来源的M S C s ，观察移植后S A P 大鼠胰腺的病理损伤修复情况，明确同种异体 来源的M S C s 能否在S A P 病理状态下迁移至损伤的胰腺组织，及不同微环境对M S C s 迁移、分化的影响，初步探讨M S
3、 C s 对S A P 大鼠胰腺损伤修复的机制。 一、骨髓问充质干细胞的原代和传代培养 目的：建立骨髓间充质干细胞原代及传代的培养方法，通过培养传代，扩增出足 量的骨髓间充质干细胞，为以后的实验做准备。 方法：在无菌条件下剪去大鼠双下肢，分离股骨，于超净台上剪开骨端，用1 0 胎牛反复冲洗髓腔直至骨干发白，1 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃上清，按5 x 1 0 S c m 2 密度 接种于含1 0 胎牛的D M E M + F 1 2 培养基中培养。2 4 h 内观察细胞的贴壁情况，此后， 每1 2 h 观察细胞贴壁情况，待细胞生长至培养瓶面积8 0 时传代。首次传代后继续定 期观
4、察、传代。传至第三代( P 3 ) 时，胰酶消化，收获细胞并计数。进行流式检测及 细胞活力测定。 结果：约2 4 h 后M S C s 开始贴壁，贴壁后M S C s 呈纺锤形及三角形等形态，并趋 向集落样生长。经传代培养后，细胞成份逐渐得到纯化，至P 3 代时细胞形态单一， M S C s 占9 0 以上。流式细胞检测结果显示，代表M S C s 的C D 2 9 + C D 4 4 + C D 4 5 。细胞 群，经过传代培养，其所占比例逐渐增大，细胞群的组成逐渐趋于单一，至P 3 代时， C D 2 9 + C D 4 4 十C D 4 5 。细胞群达到9 5 以上。培养至P 3 代时细
5、胞活力最好，约为9 6 ， P 4 代后活力逐渐下降。 结论：本部分实验建立了稳定的M S C s 原代和传代培养方法。获得的M S C s 经贴 壁传代培养，纯度达9 5 以上，流式鉴定结果显示为C D 2 9 + C D 4 4 + C D 4 5 。细胞群。这 第二军医大学硕士学位论文 为下部分实验提供了充足的M S C s 产品。 二、重症急性胰腺炎大鼠模型的建立 目的：制作S A P 动物模型，为研究胰腺损伤修复提供简便、可靠、重复性及可 比性均较好的模型，了解大鼠S A P 模型的病程规律，并为下一步实验提供关键的时 间点。 方法：雌性S D 大鼠4 6 只，体重2 5 0 3 0
6、 0 9 ，随机分为2 组：正常对照组( C O N 组，n = 6 ) ；S A P 造模组( S A P 组，n = 3 0 ) 。S A P 组分为4 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h5 个时间点，每个时间点有6 只大鼠。C O N 组大鼠3 只不做任何操作处理，3 只腹腔 注射生理盐水2 次。另取大鼠1 0 只，均S A P 造模，观察7 2 h 死亡率。造模前1 2 h 起 禁食，自由饮水，将L 广精氨酸溶于9 9 L 生理盐水中配制成浓度为2 0 9 L 的L 精氨酸 溶液，调整p H 值至7 0 左右，2 次腹腔注射( 2 5 9 k g 体质量) ，中
7、间间隔1 h 。在造 模后4 h 、1 2 h 、2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 处死动物，检测血清淀粉酶，获取胰腺、肺等组织， 固定、石蜡包、切片、H & E 染色，依据s c h m i d t 及M a y e r 评分法进行评分。并观察 三组动物7 2 h 的存活情况。 结果：造模后血清淀粉酶水平4 h ( 4 6 8 4 1 8 4 4 4 U L ) 、1 2 h ( 6 9 4 0 1 4 5 1 5 U L ) 、 2 4 h ( 9 9 8 1 2 9 0 1 6 U L ) 、4 8 h ( 3 4 3 1 士1 3 6 8 5 U L ) 、7 2 h ( 1 4
8、 9 8 1 8 6 5 9 U L ) 均显著高 于正常对照组( P 1 6 坏死细胞H P F 1 6 坏死细胞H P F ( 广泛坏死融合) 一3 3 删。帖。 2 ：3 3 ”4 =。处处处处处处处嫩 无1 2 3 4 5 6 7 第二军医大学硕士学位论文 炎症和血管周围浸润 0 0 1 个自细胞H P F ( 小叶内或血管周围) 0 52 5 个白细胞H P F 1 6 1 0 个向细胞H P F 1 51 1 1 5 个白细胞肿F 21 6 2 0 个白细胞H P F 2 52 1 2 5 个白细胞H P F 3 2 6 3 0 个白细胞H P F 3 5 3 0 个白细胞H P
9、F 或局部微脓肿 4 3 5 个白细胞H P F 或脓肿融合 6 、肺脏组织病理损伤观察 取肺脏组织置于4 中性甲醛溶液中固定2 4 h ，常规石蜡包埋，4 z m 连续切片3 - 5 张，行H & E 染色。采用单盲法由病理科医师在光镜下阅片，每张切片分别随机选择 5 个低倍( x 2 0 0 ) 和5 个高倍视野( x 4 0 0 ) ，观察肺脏组织的病理学改变，参照M a y e r 等【5 l 标准进行肺组织损伤评分( 结构损害、炎症评分：每项0 3 分) 。 M a y e r 的肺脏组织病理评分标准 7 、石蜡切片H E 染色流程 组织石蜡包埋、切片 、L 二甲苯脱蜡3 0 m i
10、 n 3 4 骨髓问充质干细胞对重症急件胰腺炎人鼠损伤胰腺的组织修复作用 无水乙醇处理1 m i n 9 5 乙醇处理l m i n 8 5 乙醇处理l m i n 7 5 乙醇处理l m i n 自来水沈2 m i n 苏木精液染色5 m i n 自来水洗2 m i n 7 5 盐酸酒精分化3 0 s 自来水洗2 m i n 蒸馏水洗1 m i n 9 5 乙醇处理1 m i n 酸化伊红乙醇染色2 m i n 9 5 乙醇脱水l m i n 2 无水乙醇处理l m i n 2 二甲苯透明l m i n 3 中性树胶封固后恒温箱烘烤过夜 一3 5 第二军匡大学硕士学位诧五 8 、数据统计及处
11、理 化学检测指标及j I j i 理评分以均数标准差( x s ) 表示，死I “半川百分牢表示。用 S P S S1 3 0 统计软件进行分析，计量资料聚用t 检验和方差分析对各组数据分布、方 差齐性及均数进行显著性检验。取P 00 5 为有统计学意义。 二、结果 ( 一) 血清淀粉酶检测结果 S D 大鼠造模后血清淀粉酶水平显著升高。罔2 1 罹示造模后4 h ( 4 6 8 4 l8 4 44 U ，L ) 、1 2 h ( 6 9 4 0 i 1 4 5 15 U f L ) 、2 4 h ( 9 9 8 1 2 9 0 16 U L ) 、4 8 h ( 3 4 3 1 1 3 6
12、85 U I ，) 、7 2 h ( 1 4 9 8 1 8 6 59 U L ) J f n 淀粉酶水平均显著高于正常对照组 ( 1 0 4 7 3 6 85 U F L 、1 0 9 8 4 18 6 U L 、1 0 3 2 3 4 73 U 几、1 0 5 5 = j - 3 1 35 U I 。、1 0 6 7 j ：3 1 18 U L ) ( P 00 5 ) 。其中S A P 纽造模后2 4 h 向淀粉晦水平届著高于其他时州点( P 00 5 ) 。 图2 1S A P 组和正常对照组大鼠的m 淀粉酶水平比较 ( 二) 大鼠7 2 h 存活率的观察 S A P 造模后，连续观察
13、7 2 h 以上对照组大鼠存活率为1 0 0 ，S A P 组大鼠存活 率为6 0 。相S A P 组中，造模后2 4 7 2 h 为死亡高峰时削段7 2 h 以后动物情况稳定， 骨髓问充质干细胞对重症急件胰腺炎人鼠损伤胰腺的组织修复作用 罕有死亡。图2 2 显示S A P 组和对照组大鼠生存曲线。 ( 三) 大体观察结果 正常对照组大鼠腹腔无渗出，胰腺及其他脏器无水肿坏死，胰腺组织呈粉红色， 组织柔软，胰胆管清晰可见，见图2 3 ，图2 4 。S A P 组大鼠腹腔见有少到中量腹水， 色混浊，呈灰黄色或暗红色。胰腺组织可见明显充血、水肿、出血，部分时间点可见 黄白色钙皂斑，并伴胃潴留，肝脏充
14、血、颜色变暗、坏死，肠肿胀坏死与腹腔室隔综 合征( 打丌腹腔后涌出于切口之外的肿胀肠管) ，肺水肿伴淤血。1 2 h 胰腺轻度充血 水肿；2 4 h 胰腺充血水肿明显，并出现坏死，伴血性腹水；4 8 h 出现胰周脂肪皂化； 7 2 h 胰腺坏死明显，胰腺组织变薄。图2 5 为S A P 大鼠2 4 小时的腹腔照片，可见暗 红色血性腹水，肠肿胀坏死，呈黑色。图2 - 6 为S A P 大鼠2 4 小时胰腺，充血、水肿 明显，并出现坏死。 图2 2 显示S A P 组和F 常对照组大鼠生存曲线比较 ( 四) 病理组织分析及评分结果 1 、胰腺组织病理分析及评分 光镜下，正常对照组胰腺组织结构清晰，
15、腺泡小叶完整，间质无渗出。见图2 7 。 3 7 第二军医走学硕士学位论丈 S A P 组4 h 胰腺问质水肿，有大量炎细胞浸润，以中性粒细胞为t ，腺泡结构尚好， 组织结构无明显破坏。1 2 h 胰腺腺泡细胞坏死，胰腺蛮质内红细胞渗出较多，胰腺坏 死、出血较4 h 明显加重，腺泡结构破坏较多。胰腺脂肪组织内“r 见人量炎细胞浸润， 脂肪组- g 内有出血坏死。2 4 h 可观察到胰腺组织人片坏死，出血及u 月品炎细胞浸涧， 腺泡结构严苇破坏，坏死区H & E 染色为粉红色无结构M 域。4 8 h 坏死加币，腺泡小 叶结构，”重破坏可见核固缩及凋亡= 小体形成，“ 状脂肪坏死形成和出I 衄，可
16、见皂化 斑。7 2 h 胰腺组织坏死到达晶高程度，见图2 - 8 ，图2 - 9 ，吲2 - 1 0 。 造模后4 h 起，胰腺病理评分逐渐甜高，4 h ( 33 5 05 9 ) 、1 2 h ( 56 3 “ E 06 5 ) 、2 4 h ( 73 3 O7 8 ) 、4 8 h ( 1 03 1 O8 5 ) 、7 2 h ( 1 25 l a 06 8 ) 。图2 - 1 1 显示随时问推穆，S A P 大鼠胰腺病理评分逐渐升高，至造模后7 2 h ，病理评分达到岛峰，显著高于其他各时 叫点( P 00 5 ) 。 2 、肺组织病理分析及评分 萨常对j ! ( c 组大鼠肿组织结构清晰，肺泡擘完整，肿间质无渗出。见图2 - 1 2 。S A P 组大鼠1 2 h 时可见肺问质水肿并有嗜L L l 性村细胞和单核细胞浸润，肺泡腔内出现浈
