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1、1 8 0 中国园艺学会热带南亚热带果树分会成立大会暨首届学术研讨会论文集 香蕉的基因工程研究进展 黄永红，易干军，周碧容，曾继吾，吴元立 ( 广东省农业科学院果树所广州5 1 0 6 4 0 ) 摘 要：香蕉是世界上一种重要的作物。近几十年香蕉生产受到了严重的病虫害威胁。大多数商业性 香蕉生长周期长。本身具有不育和多倍体特性，因此，传统育种方法在培育抗病、抗虫，优质的香蕉品种 方面很难得到广泛应用，从而影响了整个香蕉产业的健康发展。近年来。快速发展起来的基因工程技术为 培育具有优良性状香蕉品种提供了一种可行的手段。目前。遗传转化技术得到很大改进转化受体也趋于 多样化，香蕉遗传图谱的构建正在进
2、行，这必将使得香蕉品种改良得到快速发展，进而推动整个香蕉产业 进入一个新的阶段。 香蕉是世界上重要的粮食作物。产量继水稻、小麦和玉米之后列第四位。据联合国粮农组织 ( F A O ) 2 0 0 3 年统计，目前世界香蕉总产量为9 7 0 0 万吨，其中，出I = 1 量仅占总数的1 0 。因此，香 蕉为热带地区的人们提供了重要的食物保障，同时，也为农民提供了可观的收益f l 】。目前，香蕉生产 受到严重的病虫危害，包括香蕉束顶病毒( 以b u n c h yt o pv i r u s ，B B 哪香蕉穿孔线虫( R a d o p h o l u s s i m i l e s ) ，香蕉
3、细菌性枯萎病毒( R a l s t o n i as o l a n a c a e a r u m ) ，香蕉叶斑病( M y c o s p h a r e l l af i j i e n s i s ) 和香蕉枯 萎病( F u s a r i u mo x y s p o r u m f s p c u b e n s e ) 等1 2 1 。香蕉传统育种方法周期长( 6 2 0 年) ，品种倍性多样， 而且大多数食用品种具有不孕的特性，所以，尽管香蕉是发展中国家重要的粮食作物，但是具有重要 商品性的香蕉品种并不能通过传统育种方法而获得改良 1 1 。遗传转化技术的发展为把具有重要
4、农艺性 状的基因导人香蕉品种提供了有效的方法。虽然目前还没有获得释放的商品转基因品种，但是一些研 究组已报道获得了转基因香蕉 3 - 7 。本文就香蕉基因工程的进展进行综述，包括香蕉的植株再生、基 因克隆和遗传转化几个方面。 l植株再生 遗传转化的一个重要前提条件是建立高效的植株再生体系。作为一种成熟的技术，香蕉作物的组 织培养已经广泛地应用到生产实践中。但是作为外源基因的受体，香蕉遗传转化中应用外植体与一般 增殖培育中应用的的外植体不尽相同。某些香蕉基因型的愈伤组织、细胞和原生质的器官发生已有报 道限9 姗。但是，这些外植体再生植株速度慢，而且有基因依赖性。因此，在香蕉遗传转化中，应用 香蕉
5、横切薄片再生植株可能是细胞悬浮和原生质培养之外的另一种有益的选择。 1 1 横切薄层培养 细胞薄层培养是二十世纪发展起来的行之有效的实验技术。1 9 7 3 年，T r a n 1 l l 以烟草表皮细胞为 材料，获得了花、芽、根和愈伤组织的分化，这是细胞薄层培养技术最早应用的实例。后来，这项技 术应用到1 2m m 厚的植物横切薄片的组织培养，进而应用到一些植物的遗传工程中旧B l 。 1 9 9 6 年，O k o l e1 1 4 1 把这项技术首次应用到香蕉作物上，他以香蕉品种W i l l i a m s ( A A A 基因型) 、两 个菜焦品种H o r n ( A A B 基因
6、型) 和C a c h a c o ( A B B 基因型) 的横切薄片为材料，进行了直接器 官发生和愈伤组织器官发生的研究。在芽诱导增殖培养基上，平均每个外植体上可以诱导出1 5 芽， 并能够成功地再生成小植株。在愈伤组织诱导培养基上，横切薄片也能诱导出胚性愈伤组织，最终平 作者简介：黄永红，1 9 7 4 年，男，主要从事基因工程方面的研究，T e l - 0 2 0 - 3 8 7 6 5 0 0 8 ，E m a i l ：g s t s h h 1 2 6 1 3 0 1 1 1 幸通讯作者A u t h o rf o rc o r r e s p o n d e n c e 0 2
7、 0 - - 3 8 7 6 5 8 6 9 E m a i h Y i g a n j u n v i p 1 6 3 c o r n 中国园艺学会热带南亚热带果树分会成立大会暨首届学术研讨会论文集1 8 1 均每个横切薄片可以再生5 6 个植株。愈伤组织和芽的形成与外植体的部位、发育阶段和不同的基因 型相关。随后，2 0 0 1 年黄霞 1 5 利用横切薄片培养方法，研究了香蕉品种广东6 3 1 ( A A A 基因 型) 植株再生及其影响因素。通过正交试验和单因子试验确定了最佳培养条件，筛选出了五种最佳 培养基：直接器官发生培养基、愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基、分化培养基、成苗
8、培养 基。并要求愈伤组织诱导和继代培养需在黑暗中进行。最佳培养基实验结果表明，直接器官发生出芽 率为5 2 0 6 ，发生芽的外质体上平均出芽数为4 4 3 。间接器官再生愈伤组织诱导率为5 5 ，2 3 5 3 愈伤组织诱导出不定芽，平均每块愈伤组织诱导出的不定芽数为4 3 。2 0 0 3 年，陈廷素 i o - 以香蕉横 切薄层切片为材料，研究了不同因素对薄层切片芽分化的影响。结果表明，利用横切薄层培养技术能 更有效、快速地进行香蕉的无性繁殖。T D Z 对香蕉薄层切片芽的分化有抑制作用，没有得到生长正常 的不定芽；横切薄层切片在暗培养且培养温度为3 0 时比2 5 有较高的不定芽分化率
9、，不定芽分化 能力强，丛芽多；蔗糖和A g N O ，对薄层切片芽分化有一定的影响。 1 2 胚性细胞悬浮 体细胞胚胎发生技术最初是作为大量微繁和遗传改良( 遗传转化和细胞质融合) 的细胞工具而发 展起来的。这些技术是基于合成性的生长调节剂( 生长素) 的应用，来诱导组织的脱分化和胚性组织 ( 愈伤组织) 的形成。这些愈伤组织是建立胚性细胞悬浮系( E C S ) 的初始材料，悬浮系进而产生出 胚。再生成完整小植株。 建立香蕉作物的E C S 有四种方法。每一种方法都是基于不同的外植体类型：合子胚【t 7 ，堋、球茎 薄片和叶鞘 8 1 、未成熟雄，雌花 1 9 - 韧、具有高度增殖能力的多芽
10、体分生组织性的表层结构物( s c a l p ) 培 养隗矧。 最常用的建立E C S 方法用未成熟的雄花和多芽体为初始材料。台湾大学的马教授摸索出的培养 基和从雄花建立胚性细胞悬浮系的方法是香蕉作物体细胞胚性发生体系的重大突破，并由此启发了了 大量的研究 1 9 1 。建立E C S 的第一步是形成胚性愈伤组织，可参照E s c a l a n t 的方法嗍，悬浮性的建 立、维持、和再生阶段可以参照G r a p i n 【2 5 1 和C o t ee ta l 的方法1 2 6 1 。对于没有雄花的品种，也可以用 未成熟的雌花为初始材料参照马教授的方法建立E C S 。魏岳荣 2 3
11、1 以东南亚广为种植的香蕉品种贡 焦的未成熟雄花为材料建立了E C S 。最终结果体细胞胚萌发率为1 7 2 8 ，1 4 1 6 的体细胞胚能正常 再生成正常植株。 S c a l p 方法是基于从茎尖产生的高度增生物的培养。与未成熟的雄，雌花方法相比，这种方法适用 于大多数香蕉基因型品种。且具有外植体采集没有时间限制的优势。D h e d a 等 9 1 首次利用此方法用 具有高度增生能力的煮食香蕉品种B l u g g o e ( A B Bg e n o m e ) 的多芽体建立了E C S 。随后，S c h o o f 等【捌 用改良的技术获得了A A A 基因型的品种G r a
12、n d e N a i n e a n d G r o s M i c h e l 的多芽体。并建立了胚性 细胞悬浮系。2 0 0 5 年，魏岳荣等 2 “ 1 以我国重要香蕉种质过山香( A A B ) 为材料，研究了香蕉多 芽体诱导、多芽体茎尖薄切片愈伤组织诱导和体细胞胚发生的合适条件。结果表明，该品种单个不定 芽茎尖在P 4 培养基中继代5 个周期后可诱导获得类似花椰菜结构的多芽体。从多芽体所获得的s c a l p 在愈伤组织诱导培养基中黑暗培养4 5d 后愈伤组织诱导率可达9 7 6 。诱导2 0d 后黄色分生小球 体类结节状愈伤组织开始发生。9 0 。1 2 0d 后在分生小球体局
13、部可获得白色或浅黄色松散的胚性愈伤 组织( 诱导率为1 7 5 ) 。从胚性愈伤组织诱导的体细胞胚在成熟培养基上培养6 0d 后体胚萌发率和 植株转化率分别为1 4 5 和11 1 。 2 基因克隆 应用目前发展起来的转化方法，遗传转化在香蕉作物的基因改良方面显现出了重要的作用。但首 1 8 2中国园艺学会热带南亚热带果树分会成立大会暨首届学术研讨会论文集 要的是有一定的可以提供抗病虫或者改良果实品质的可转化的基因。可喜的是，一些有益基因已经克 隆出并测序。 2 1 香蕉果胶裂解酶 香蕉是典型的呼吸跃变型果实，其成熟受乙烯诱导。在香蕉后熟阶段发生重要的生理变化，细胞 壁溶解，果实软化。1 9
14、9 7 年，D o m i n g u e zP u i g j a n e r 等闭通过差示筛选( d i f f e r e n t i a ls c r e e n i n g ) 从香蕉 果实c D N A 文库中克隆出一种编码与果胶裂解酶同源的c D N A B a n l 7 。N o r t h e r n 分析表明。该克 隆的m R N A 最初是在跃变早期的果实中被发现，然后在跃变峰处达到最大值，接着在过熟时含量下 降。由该m R N A 序列推导出的氨基酸的序列与从花粉和一些植物病原菌中得到的果胶裂解酶( p e c t a t e l y s a s e ，P L ) 有
15、显著的同源性，病原菌P L 被证明可以分解植物细胞壁果胶物质。因此B a n l 7 可能 在果实成熟过程中果实软化方面起作用。2 0 0 3 年，张德有等嘲通过R T P C R 获得果胶裂解酶的c D N A ，并克隆测序，与已报告的序列进行了比较，二者核苷酸序列的同源性达9 9 2 4 ；推测的氨基酸 序列也具有很高的同源性，达9 7 7 。通过R T P C R 的方法对香蕉不同组织和不同成熟度果实的果 胶裂解酶基因的表达进行了研究。结果表明该基因只在果实中表达，具有组织特异性，而且只在果实 的特定发育阶段表达。 2 2 黄瓜花叶病毒 黄瓜花叶病毒是一种普遍危害香蕉的病害。1 9 9
16、6 年，李华平1 3 0 l 对侵染香蕉的黄瓜花叶病毒广东 3 个株系的衣壳蛋白( c P ) 基因进行了克隆和序列分析。结果表明，C P 基因开放阅读框长6 5 7 个核 昔酸，可编码2 1 8 个氨基酸。3 个株系M M ，B S 和C S 问核苷酸序列同源率为9 6 6 5 一9 7 1 1 ，其中， B S 与C S 关系紧密，而与M M 关系稍远。3 个株系与其它C M V 株系相比较，显示了与C M V 亚组I 比 与亚组I I 有较紧密的同源关系。2 0 0 2 年，杜道林等 3 1 】从海南大田感染香蕉花叶病的香蕉叶片，获 得香蕉花叶病毒，提纯其R N A ，合成c D N A 第一链，经P C R 扩增，获得一约7 0 0b p 的D N A 片段，测序 结果显示所克隆的D N A 片段包含一完整的香蕉花叶病毒株系( C M V B H I ) 外壳蛋白基因，长度为
