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1、生物技术制药复习题第一章 绪论第一节 生物技术的发展史1、生物技术：以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有与其性状的新物种或新品系，并与工程结合，利用这样的新物种进行加工生产，为社会提供商品服务的一个综合性技术体系。它的范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。基因工程是生物技术的核心。P12、蛋白质工程-第二代基因工程；海洋生物技术-第三代生物技术P13、生物技术发展史：传统、近代（抗生素、发酵罐）、现代（DNA重组）P31974年，Boyer和Cohen建立了DNA重组技术1975年，Koher 和 Milstein 建立了单克隆抗体技术1982年，第一个基因工
2、程药物重组人胰岛素被批准上市1989年，我国第一个基因工程药物干扰素批准上市2003年，中国的重组腺病毒-p53注射液成为石阶上第一个正式批准的基因治疗药物。第二节 生物技术药物1、生物技术制药：生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。P42、生物技术药物：采用DNA重组技术活其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。它与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品共同归为生物药物。3、现代生物药物分为4类：重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；基因药物；天然药物；合成与部分合成药物。4、生物药物按用途分为：治疗药物；预防药物；诊
3、断药物。5、生物技术药物的特征：（1）分子结构复杂；（2）具有种属特异性；（3）治疗针对性强、疗效高；（4）稳定性差（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络性效应；（10）检验的特殊性。第三节 生物技术制药1、生物技术制药的特征：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益。P52、生物技术在制药中的应用有哪些？P7（1）基因工程制药： 开发基因工程药物，如干扰素（IFN）、红细胞生成素（EPO）等 基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗 基因工程抗体，它可以作为导向药物的载体 基因诊断与基因治疗应用基因工程技术建立新药的筛选模型 应用极影工程激活素改良菌种
4、，产生新的微生物药物 改进药物生产工艺 利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。（2）细胞工程制药单克隆抗体技术 动物细胞培养 植物细胞培养生产次级代谢产物。（3）酶工程制药 ：酶与细胞的固定化及酶转化制药（4）发酵工程制药：发酵工艺改进、新药研制、菌种改造。第二章 基因工程制药第一节 概述（略）第二节 基因工程药物的生产过程P151、基因工程技术：将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。2、基因工程药物制造的主要程序 （过程）（重点和后面几节联系起来）（1）目的基因的克隆（分离目的基因）：通
5、过逆转录、反转录-聚合酶链式反应、化学合成方法来制备cDNA，再通过核酸探针杂交或免疫反应来筛选目的基因（2）目的基因与载体连接构建DNA重组体：通过限制性内切酶DNA连接酶等核酸酶，把目的基因组入载体的相关克隆位点，常用的载体有质粒载体和噬菌体载体（3）将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌：常用的宿主菌有大肠杆菌、酵母菌等，先使宿主菌处于感受态，再通过转化、转导等方式把重组DNA导入宿主菌，以构建工程菌（4）工程菌发酵：提供适当的培养基、反应器、控制好发酵过程中的各种参数，如温度、PH、溶氧等，并通过升温来诱导产物表达（5）目的基因表达产物的分离纯化：通过固液分离、初步纯化、高度纯化、成品加工
6、来制备产品；若是胞内产物需要细胞破碎，若是包涵体则需要变性和复性（6）产品的检验：检测产品的质量和性能 。第三节 目的基因的获得1、利用基因工程生产蛋白质或多肽需要得到其基因，制备目的基因常用的方法有哪些？P16 （1）逆转录法 以mRNA为模板，经逆转录的到cDNA，构建cDNA文库，从cDNA文库中筛选目的基因。由于RNA转录加工过程中，内含子序列已被剪切掉，因此，cDNA文库中无内含子，适于在原核系统中表达。但是，cDNA只包含蛋白质的结构基因部分，缺少有关的调控序列，因此在原核系统中表达，还需要根据表达载体的结构，配以相应的调控序列。 （2）利用反转录-聚合酶链式反应制备基因 （3）化
7、学合成法：只适用于克隆小分子肽的基因 2、利用逆转录法获得目的基因的基本过程P16 （1）mRNA的纯化 ：从表达目的基因的细胞中提取总RNA，用寡聚脱氧胸苷（dT）纤维素柱从总RNA中提取纯化mRNA。 （2）cDNA的合成 ：以mRNA为模板，利用逆转录酶合成cDNA第一链，再用DNA聚合酶合成cDNA的双链。（3）cDNA克隆：利用合适的连接方法，将产生的双链cDNA片段插入到合适的载体中。 （4）构建cDNA文库 ：将cDNA与载体连接的重组体转入大肠杆菌中，产生的克隆群体为cDNA文库。 （5）从cDNA文库中筛选目的基因 ：得到cDNA文库后，通常采用核酸探针杂交法和免疫反应鉴定法
8、从数以万计的DNA片段中筛选出目的基因。3、载体分为：表达型载体和非表达型载体。P17第四节 基因表达1、基因表达：指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。P202、基因高效表达研究：指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。P203、基因表达的微生物宿主细胞分为两大类：P21第一类为原核细胞（常用的有大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等）； 大肠杆菌（目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系）：表达基因产物形式多样，大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。因分泌能力不足，真核蛋白质常
9、形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。其内毒素很难除去。枯草芽胞杆菌：分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。链霉菌：作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。第二类为真核细胞（常用的真核微生物有酵母、丝状真菌等） 酵母：酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达丝状真菌：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切糖基化）有成熟的发酵和后
10、处理工艺。4、目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母。P225、大肠杆菌基因表达载体P23（1）pBV220系统pBV220系统国内使用最多的载体,其组成：来源于pUC8多克隆位点；核糖体rrnB基因终止信号；pBR322第42253735位；pUC18第2066680位；噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子；pRC23的PL启动子及SD序列（2）pET系统6、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素P22外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于：（1）外源基因的剂量 ：一般来说细菌内基因拷贝数增加，基因的表达产物也增加。 （2）外源基因的表达效率 启动子的强弱
11、： 启动子是在转录水平上影响基因表达的因素。需要寻找强的启动子。 核糖体结合位点的有效性：大肠杆菌核糖体结合位点对真核基因在细菌中的高效表达是十分重要的。 SD 序列和起始密码ATG的间距 ：表达非融合蛋白的关键是原核SD序列和真核起始密码ATG之间的距离，距离过长过短都影响真核基因的表达。 密码子组成：应选择使用大肠杆菌偏爱的密码子。 （3）表达产物的稳定性： （4）细胞的代谢负荷 ：必须使宿主细胞的代谢负荷不至过重，又能高效表达出外源基因产物。 （5）工程菌的培养条件 外源基因的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，而且与其所处的环境条件息息相关，必须进行优化。 7、
12、真核基因在大肠杆菌中的表达形式P26以融合蛋白的形式表达药物基因 以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。 优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达； 缺点：只能作抗原用。以非融合蛋白的形式表达药物基因 非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 优点：保持原有蛋白活性； 缺点：易被蛋白酶破坏。分泌型表达药物基因（外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游） 优点：在周质中稳定，有活性，不 含蛋氨酸残基； 缺点：产量不高， 信号肽不被切割。8、载体相关定义载体：在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细
13、胞的一种能自我复制的DNA分子。克隆载体：从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为载体，在其上插入合适大小的外源DNA片段，将重组后的载体引入到宿主细胞中，并在宿主细胞中大量繁殖。表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，是目的基因能够表达的载体。穿梭载体：指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的载体（例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体）。9、载体的复制系列可分四类： P27（1）Yep类（酵母附加体质粒）（2）YRp类（酵母复制型质粒）（3）YCp类（酵母着丝粒质粒）（4）YIp类（酵母整合型质粒）10、影响目的基
14、因在酵母菌中表达的因素外源基因的拷贝数外源基因的表达效率：启动子分泌信号的效率终止序列的影响外源蛋白的糖基化宿主菌株的影响：菌体生长力强 菌体内源蛋白酶要较弱 菌体性能稳定 分泌能力强11、精确表达载体P28酵母载体有两类：普通表达载体和精确表达载体。精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后氮末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸的克隆载体。第五节 基因工程菌生长代谢的特点1、碳源物质为细胞提供能量，当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢提供的能量时，菌体会产生乙酸，导致培养基的pH值下降，从而影响菌体的生
15、长。适当提高pH，可减少乙酸的抑制作用；P31第六节 基因工程菌的不稳定性1、质粒不稳定分为那两类？P32工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。 质粒的分裂不稳定是指工程菌在分裂时出现一定比例的不含质粒的子代菌的现象。与含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；这两种菌比数率差异的大小有关质粒的结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变。基2、提高质粒稳定性的方法P33（1）选择合适的宿主菌：遗传稳定（2）选择合适的载体：高拷贝数；（3）选择压力：如加抗生素提高稳定性；（4）分阶段控制培养：先使菌体生长至一定密度；再诱导外源基因的表达 （5）控制培养条件 （6）固定化第八节 重组工程菌的培养1、基因工程菌的培养方式P36（1） 分批培养（2）补料分批培养：将种子接入发酵反应器中进行培养,经过一段时间后间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的方法。（3）连续培养（4）透析培养（5）固定化培养2、基因工程菌的培养工艺P37（1） 培养基的影响（2） 接种量的影响（3）温度的影响（4）溶氧量的影响
