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1、青霉素生产工艺山东农业大学 生命科学学院 2008 级生物工程三班 孙启星摘要青霉是产生青霉素的重要菌种。广泛分布于空气、土壤和各种物上，常生长在腐烂的柑桔皮上呈青绿色。青霉素的发现和大规模地生产、应用，不仅对抗生素工业的发展起了巨大的推动作用，而且防治了各种疾病，延长了人类的平均寿命。因此，青霉素的生产受到了各国关注。青霉素的发酵工艺与设备也在不断地创新发展。关键词：青霉素 发酵 引言 发酵的成功不仅取决于技术，而且与设备密切相关，本文注重从发酵角度分析青霉素生产工艺， 。正文：1.孢子的制备:这是发酵工序的开端，是一个重要环节。抗生素产量和成品质量同菌种
2、性能以及同孢子和种子的情况有密切关系。生产用的孢子需经过纯种和生产能力的检验，符合规定的才能用来制备种子 。保藏在砂土管或冷冻管中的菌种，在接入种子罐以前，需经过扩大繁殖才能获得接种所需要的孢子数。扩大繁殖的方法有两种： 孢子进罐法： 在培养基上生长繁殖成大量的孢子，此法是目前生产抗生素孢子常用的方法。优点：工艺过程简单，并且一次可以制备大量的孢子，易于保存，不易染菌。缺点：砂土管或冷冻管用量太大。 摇瓶菌丝进罐法： 即先将固体培养基上繁殖的孢子接入摇瓶液体培养基中，使其生长繁殖成菌丝，再转入种子罐内，此法适用于生长发育缓慢的放线菌。优点：可以节约砂土管或冷冻管用量。缺点：菌丝不宜保藏，批号更
3、换频繁，批与批之间的差异容易造成生产上的波动；孢子制备工艺时间拖长，容易染菌。2.种子的制备: 使孢子发芽、繁殖和获得足够数量的菌丝，以便接种到发酵罐当中去。种子制备从摇瓶培养开始，再接入种子罐进行逐级扩大培养。孢子瓶中的孢子（或摇瓶菌丝）被接入到体积较小的种子罐中，经过培养后孢子即发芽繁殖成大量的菌丝，然后接入到体积较大的种子罐内，经过培养繁殖成更多的菌丝，然后再转入发酵罐内进行抗生素的生物合成。3.灭菌 发酵开始前，有关设备和培养基必须先经过灭菌，后接入种子。 工业上常用的方法有：干热灭菌、湿热灭菌、化学药剂灭菌、射线灭菌和介质过滤除菌等几种。在实际的青霉素生产中采用了湿热蒸汽灭菌中的“实
4、罐灭菌（即分批灭菌）法”和连续灭菌。实罐灭菌各路进气要畅通，防止短路逆流，罐内液体翻动要激烈；各路排汽也要畅通，但排汽量不宜过大，以节约用气量。在保温阶段，凡进口在培养基液面以下的各管道及冲视镜管都应进汽；凡开口在液面之上者均应排汽。无论与罐连通的管路如何配制，在实消时均应遵循“不进则出”的原则。在引入无菌空气前，应注意罐压必须低于过滤器压力，否则物料将倒流入过滤器内。 连续灭菌 灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配好的料液预热到 6070，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料液的温度很快升高到灭菌
5、温度（126132） ；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经过冷却管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到 4050后，输送到预先已经灭菌过的罐内。 发酵罐 1. 特点：1）.结构上具有适宜的径高比。发酵罐的高度与径高比一般为 1.74，罐身越长，氧气的利用率越高。2）.有一定的刚度与强度，由于发酵罐在灭菌过程和工作时，罐内有一定的压力和温度。因此需要一定的强度。3）.搅拌通风装置使之气液充分混合，保证发酵液一定的溶解氧。4）.足够的冷却面积。5）.尽量减少死角。6）.轴封严密。7）.维修操作检测方便2. 结构好
6、气性机械搅拌发酵罐是密闭式受压设备，主要部件包括罐身、搅拌器、轴封、打泡器、中间轴承、空气吹管（或空气喷射管） ，挡板、冷却装置、人孔等搅拌装置 在发酵罐内设置机械搅拌有利于液体本身的混合和气液及液固间的混合，以及质量和热量的传递，特别对氧的溶解具有重要的意义，因为它可以加强气液间的湍动，增加气液接触面积和延长气液接触时间。 消沫装置 内置：防止泡沫外溢，它是在搅拌轴或罐顶另外引入的轴（指搅拌轴由罐底伸入时）上装上消沫桨。另一类置于罐外，目的是从排气中分离已溢出的泡沫使之破碎后将液体部分返回罐内。最简单的是桨式消沫桨。4.发酵这一过程的目的主要是为了使微生物分泌大量的抗
7、生素。发酵开始前，有关设备和培养基必须先经过灭菌，后接入种子。接种量一般为 520%。发酵周期一般为 45 天，但也有少于 24 小时，或长达二周以上的。在整个过程中，需要不断通气和搅拌，维持一定的罐温和罐压，并隔一段时间取样进行生化分析和无菌试验，观察代谢变化、抗生素产生情况和有无杂菌污染1）碳源控制 采用连续添加葡萄糖的方法。苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作为青霉素 G的侧链前体。菌体对前体的利用有两个途径：直接结合到产物分子中或作为养料和能源利用，即氧化为二氧化碳和水发酵液中前体浓度以始终维持在 0.1%为宜。生产上用间歇或连续添加低浓度苯乙酸的方法，以保持前体的供
8、应速率略大于生物合成的需要。 2)PH 控制在青霉素发酵过程中，pH 是通过下列手段控制的：如 pH 过高，则添加糖、硫酸或无机氮源；若 pH 过低，则加入碳酸钙、氢氧化钠、氨或尿素，也可提高通气量。另外，也可利用自动加入酸或碱的方法，使发酵液 pH 维持在6.87.2，以提高青霉素产量。 3)温度控制 青霉菌生长的适宜温度为 30，而分泌青霉素的适宜温度是 20左右，因此生产上采用变温控制的方法，使之适合不同阶段的需要补料控制 4)补料控制发酵过程中除以中间补糖控制糖浓度及 pH 外，补加氮源也可提高发酵单位。经试验证实：若在发酵 6070h 开始分次补加硫酸铵，则在 90h 后菌丝含氮量几
9、乎不下降，维持在 6%7%， ，且 60%70%的菌丝处于年幼阶段，菌丝呼吸强度维持在二氧化碳量近 30l/（mg 菌丝h） ，抗生素产率为最高水平的30%40%；而不加硫酸铵的对照罐，在发酵中期菌丝含氮量为 7%，以后逐级下降。至发酵结束时为 4%。发酵结束时呼吸强度降至二氧化碳量为 16l/（mg菌丝h） ，且抗生素产量下降至零，总产量仅为试验罐的 1/2。因此，为了延长发酵周期，提高青霉素产量，发酵过程分次补加氮源也是有效的措施。5.提取和精制: 发酵液的预处理 发酵液中杂质很多，其中对提炼影响最大的高价无机离子（如钙、镁、铁离子等）和蛋白质。因此要先将这些杂质除去。对于钙离子，通常加草
10、酸使之形成草酸钙沉淀；对于镁离子，通常加三聚磷酸钠可与镁离子形成可溶性络合物；对于铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。蛋白质胶体的去除可调节 pH 到其等电点，或者采用加热、加入明矾或食盐等无机盐，或者采用蛋白质絮凝剂来除去。多级错流萃取 在此法中，料液经萃取后，萃取液再与新鲜萃取剂接触，再进行萃取。图 9-1 表示三级错流萃取过程，第一级的萃余液进入第二级作为料液，并加入新鲜萃取剂进行萃取。第二级的萃余液再作为第三级的料液，也同样用新鲜萃取剂进行萃取。此法特点在于每级中都加溶媒，故溶媒消耗量大，而得到的萃取液平均浓度较稀，但萃取较完全。 吸附法 利用吸附剂与抗生素之间的分
11、子引力而将抗生素吸附在吸附剂上。常用的吸附剂有活性炭、白土、氧化铝、各种离子交换树脂等。 溶媒萃取法 当抗生素以不同的化学状态（游离或成盐状态）存在时，在水及水不互溶的溶媒中有不同的溶解度。利用溶解度的差异来进行提取的方法就是溶媒萃取法。 离子交换法 利用离子交换树脂和抗生素之间的化学亲和力，有选择性的将抗生素吸附上去，然后以较少量的洗脱剂将它洗下来。 沉淀法 是一种分离抗生素简单而经济的方法，浓缩倍数高，因而也是很有效的方法。6.成品鉴定: 成品鉴定是根据药典的要求逐项进行分析，包括效价鉴定、毒性试验、无菌检查、热源质试验、水分测定、水溶液酸碱度及混浊度测定、结晶颗粒的色泽及大小的测定等。对于药典上未有规定的新抗生素，则可参照相近抗生素，按经验规定一些指标。7. 成品分装:抗生素产品一般分装为大包装的原料药，以供制剂厂进行小包装或制剂加工。也有一些抗生素工厂在无菌条件下用自动分装机进行小瓶分装。参考文献 1.青霉素发酵使用手册 北京东方仿真技术有限公司 2005 年 8 月2.生物工艺学 俞俊堂 化学工业出版社3.教师课件
