第一章,蛋白质化学,本章内容,蛋白质的生物学功能 蛋白质的组成 氨基酸的化学 蛋白质的结构 蛋白质分子结构与功能的关系 蛋白质的性质 蛋白质的分离纯化 蛋白质的分类,生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断自我更新 恩格斯《反杜林论》1878,概念：,蛋白质（protein，简写pro): 是由20种天然的L-α- 氨基酸按一定的顺序（序列）通过酰胺键（肽键）缩合而成的，具有较稳定构象并有一定生物功能的生物大分子一、蛋白质的生物学功能,1、催化作用 几乎所有的酶都是蛋白质,膜 蛋 白,2、生物体的结构成分,3、运输和储存,血红蛋白在血中输送氧 肌红蛋白在肌肉中输送氧,膜蛋白起运输作用,4、运动作用： 动物的肌肉收缩、细菌的鞭毛运动,5、免疫保护作用,抗体,Antibody,Ab,6、激素作用： 胰岛素等 7、接受和传递信息的受体： 受体蛋白，,8、控制细胞生长、分化： 生长因子、阻遏蛋白 9、毒蛋白： 植物、微生物、昆虫所分泌 10、许多蛋白在凝血作用、通透作用、 营养作用、记忆活动等方面起重要作用二、蛋白质的组成,（一）蛋白质的元素组成： C、H、O、N 及少量的 S 特点：N 在各种蛋白质中的平均含量为16% 用定氮法可测定蛋白质含量： 蛋白质含量(g) = 蛋白质含氮量×6.25,(二）蛋白质的水解,1、完全水解：用浓酸、碱将蛋白质 完全水解为氨基酸。
酸水解：无消旋作用，产物为L- 氨基酸 碱水解：多数氨基酸被破坏，有消旋现象2、部分水解： 一般用酶或稀酸在较温和条件下，将蛋白质分子切断，产物为分子大小不等的肽段和氨基酸蛋白酶： 胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶等三、氨基酸的化学,氨基酸（amino acid, 简写aa)： 蛋白质的基本组成单位，是含氨基的羧酸 天然蛋白质由20种氨基酸组成一）氨基酸的结构,1、通式：,α-氨基酸中α碳原子为不对称碳原子（除甘氨酸）,α,由通式可得出：,1）组成蛋白质的aa都是α-氨基酸 （除脯氨酸 α—亚 氨基酸外） ； 2）不同aa仅R链不同； 3）除甘氨酸外，其余aa的α-碳原子 均为不对称碳原子2、 α-氨基酸的构型：,构型：由于基团或原子在空间排列的不对称性 而引起的光学活性立体结构称立体构型 立体构型： 氨基在左为L-型； 氨基在右为D-型,（二）氨基酸的种类及结构,1、按结构可分为： （1）脂肪族侧链：,甘氨酸 丙氨酸 缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸,丝氨酸,脯氨酸,苏氨酸,2）芳香族侧链：,苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸,3）含硫侧链：,半胱氨酸,甲硫氨酸,4）含氮碱性侧链：,组氨酸 赖氨酸 精氨酸,5）酸性及酰胺侧链：,天冬氨酸 谷氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺,2、按R基团的极性分：,,Gly, G Ala, A Val, V Leu, L Met, M Ile, I,Phe, F; Tyr, Y; Trp, W,Ser, S Thr, T Cys, C Pro, P Asn, N Gln, Q,Lys, K; Arg, R; His, H,Asp, D; Glu, E,3 按其亲水性、疏水性可分为：,4、按人体是否可合成来分：,必需氨基酸：机体不能自身合成，必须由食物供给的氨基酸。
赖、色、苏、缬、甲硫、亮、异亮、苯丙 半必需氨基酸：人体可合成，但幼儿期合成速度不能满足需要 组*、精*、 非必需氨基酸：机体可自身合成的氨基酸5、稀有氨基酸：,胱氨酸：2个半胱氨酸脱氢形成胱氨酸,羟脯氨酸（胶原蛋白） 鸟氨酸（甲状腺蛋白）,6、非蛋白质氨基酸：,L-瓜氨酸、 L-鸟氨酸：参加尿素循环； β-丙氨酸：维生素前体； γ-氨基丁酸：神经递质； D-谷氨酸、 D-丙氨酸：细菌细胞壁的组分三）氨基酸的重要理化性质,1、一般物理性质： 2、两性解离与等电点（两性性质）： （1）氨基酸为两性电解质：,（2）aa解离方式取决于所处环境的pH：,（3）等电点（isoelectric point, 缩写为pI）,定义：aa净电荷为零时的溶液的pH为该aa的 等电点,An acidic amino acid pI=(pK1+pKR)/2,A basic amino acid pI=(pKR+pK2)/2,（4）pI的测定：,基于aa所带基团均可解离； 酸碱滴定法； 得到弱酸弱碱曲线； 根据aa上可解离基团的pK值计算等电点： pK：解离常数 以甘氨酸为例：,（5）等电点的计算,由式可知解离常数：,,由此可知： 已知在pI时， [R+]= [R-]， ∴ 整理可得：,,K1 K2 =,[H+ ]2,两边取负对数： -lg [H+ ] 2 = - lg K1 － - lg K2 ∵ -lg [H+ ] = pH - lg K1 = pK1 - lg K2 = pK2 ∴ 2 pH = pK1 + pK2 令 pI为等电点时的pH，则 pI = ½ （ pK1 +pK2） Gly：pI = ½（2 .4 + 9.6) = 5.97,由此可知: 等电点相当于该aa两性离子状态两侧基团pK值之和的一半。
A、对侧链R基不解离的中性氨基酸： pI=1/2（ pK1+ pK2） 即：等电点pH值与离子浓度无关，只取决于兼性离子两侧基团的pK值B、对有三个可解离基团的氨基酸：,如：酸性氨基酸、碱性氨基酸的pI计算： a、先写出其解离公式； b、后取兼性离子两侧基团的pK值的平均值如：天冬氨酸,如赖氨酸：,总结,a、各种aa的pI不同； b、同一pH下，各种aa所带电荷不同； pH＜pI ：aa+ pH＞pI：aa- 用离子交换、电泳将aa分开 c、处于pI时，aa溶解度最小，易沉淀； 可分离aa3、紫外吸收性质：,只有芳香族氨基酸有紫外吸收能力，因其含有苯环共轭双键的R侧链 酪氨酸 λmax：270nm 苯丙氨酸λmax ：259nm 色氨酸 λmax ：279nm 所以，测样品280nm处的光吸收值，可知溶液中蛋白质浓度此法快速简便酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103; 苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102; 色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;,,4、氨基酸的重要化学性质,（1）与茚三酮的反应： α-氨基酸与水合茚三酮溶液共热，引起aa氧化脱氨、脱羧，水合茚三酮与反应产物（氨和还原型茚三酮）生成兰紫色化合物（Pro和Hyp呈黄色），色深与溶液中氨基浓度成正比。
570nm,570nm,440nm,Pro(Hy-Pro),桑格尔反应（SANGER REACTION）,鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸,弱碱性,Edman反应,能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离DNS-Cl反应,用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定氨基酸 原理DNFB法相同，是氨基酸的α- NH2参加的反应 DNS-氨基酸在紫外灯下发黄绿色荧光 由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍 可用于微量氨基酸的定量，样品最低用量可在5pmol,与甲醛的反应,,第二节 肽,一 肽和肽键的结构： 1. 肽（peptide)：一个氨基酸的α-羧基和另一氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物2、肽链的基本连接方式——肽键,肽键(peptide bond)：为1个氨基酸的α-氨基和另一氨基酸的α-羧基之间脱水后形成的共价键，即酰胺键 此为蛋白质中氨基酸连接的基本方式1）肽键具高度稳定性； 2）具双键性质，不能自由转动； 3）肽单元呈平面化和刚性性质； 4）C=O与—NH反式排列3、肽链间/内的连接——二硫键：,概念：由肽链中相应部位上两个半胱氨 酸脱氢连接而成，此称胱氨酸残基，是连接肽链内或肽链间的主要桥键。
功能：稳定肽链空间结构；赋予一定生 物活力二硫键的连接， 种类有多种,例：胰岛素,胰脏中胰岛β-细胞分泌的一种蛋白质激素 功能：降低血糖 结构： A链：21aa；B链：30aa； 链间有两对二硫键； 在A链内aa6和aa11间 以二硫键连成小环如：牛胰岛素,多肽（polypeptide)：多个氨基酸以肽键连接方式形成.,书写习惯：左N右C；一端是游离氨基；另一端为游离羧基 肽链中的氨基酸已非完整分子，称氨基酸残基(animo acid residue);,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序 书写习惯：左N右C；通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,4、天然存在的活性肽,活性肽(active peptide)：存在于生物体内，具各种特殊生物学功能的肽谷胱甘肽（GSH）：GSH+GSH=GSSG 多肽激素：如催产素、加压素、肾上腺皮质激素、胰高血糖素、舒缓激肽等； 脑肽：脑啡肽、内啡肽： 抗生素：如短杆菌肽、放线菌素D 毒素等,活性肽,活性肽,,+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽,活性肽,二 蛋白质的分子结构,（一） 蛋白质的一级结构(Primary structure) 1.定义 蛋白质的一级结构：蛋白质分子中氨基酸组成、排列顺序及二硫键的位置。
包括： (1)组成蛋白质的多肽链数目. (2)多肽链的氨基酸顺序， (3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置 ★其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础 2. 维持蛋白质一级结构的作用力（化学键）是肽键和二硫键,3.测定蛋白质的一级结构的要求,A.样品必需纯（97%以上）； B.知道蛋白质的分子量； C.知道蛋白质由几个亚基组成； D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数 E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量4.蛋白质测序的策略,测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质分子的多肽链 断开多肽链内的二硫键 分析每一个肽链的氨基酸组成 测定多肽链的N-末端和C-末端氨基酸残基 将多肽链裂解成较小的片断 测定各肽段的氨基酸序列 重建多肽链的一级结构 确定二硫键的位置,5 蛋白质一级结构测定的一般方法,1）确定氨基酸组成： 酸解、分离、显色、定量测定； 2）氨基酸末端分析： N末端分析: 异硫氰酸苯酯（PITC法） 2，4-二硝基氟苯法 (DNFB) 丹磺酰氯法（DNS法） 氨肽酶法 C末端分析: 化学法、羧肽酶法,氨/羧肽酶法： 氨/羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-（C-）端逐个的向里水解。
从而知道蛋白质的N-末端残基顺序Ser–Gly–Tyr–Ala–Leu,,,肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离①化学法：溴化氰及无水溴化氰. 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸羧基所形成的肽键 羟胺（NH2OH）断裂 断裂Asn-Gly 之间的肽键,3）将多肽特异地裂解成较小的肽：,,②酶解法,胰蛋白酶（Trypsin):Arg/Lys羧基端参与形成肽键,糜蛋白酶(Chymotrypsin)：芳香氨基酸羧基端参与形成的肽键。