三、酵母中的基因表达,1.载体：（1）根据载体的复制序列可分为4类：YEp（酵母附加体质粒）、YRp（酵母复制型质粒）、YCp（酵母着丝粒质粒）、Yip（酵母整合质粒）YEp：此类载体以酵母的天然2μ质粒为基础，带有2μ质粒复制区序列，拷贝数高，转化频率高、稳定性好，应用较广YRp：复制序列为非2μ来源的自主复制序列，稳定性差，拷贝数少,YCp：有ARS、端粒、着丝粒等，类似于染色体的行为，稳定性好，但拷贝数只有1个YIp：可完全整合到酵母染色体中，稳定性好，但拷贝数只有1个2）酵母克隆载体：①含有大肠杆菌的复制原点和抗性基因，可在大肠杆菌中克隆增殖②也可在酵母中进行复制和表型选择酵母表型选择为营养缺陷型（合成氨基酸或核苷酸的酶系突变缺失）或抗性筛选3）表达载体：将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入载体的适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体①普通表达载体：只能方便引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸是否增加并无严格要求②精确表达载体：要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于插入外源基因，并使其在表达加工后N末端氨基酸序列与天然产物相同。
如在构建α-因子精确表达载体时，在其Arg85后引入酶切位点，同时Arg也为酵母蛋白酶断裂位点2.影响目的基因在酵母菌中表达的因素,（1）外源基因的拷贝数：有些酵母质粒导入细胞后在传代培养中丢失；整合质粒很稳定，但拷贝数低，不能高效表达；高度稳定的高拷贝数的质粒可使外源基因高效表达，但高拷贝数常会引起细胞生长量的降低2）外源基因的表达效率：主要与启动子、分泌信号和终止序列有关①启动子：由上游激活序列和保留的近端启动子组成近端启动子含有转录必须的TATA序列和mRNA起始转录位点ATG终止子区含有终止转录所需信号组成型启动子：如果外源基因表达产物对酵母细胞不利，会使细胞生长不良，达不到所需的细胞密度诱导型启动子：,②分泌信号的效率：分泌信号包括信号肽部分及前导肽部分的编码序列，可帮助表达产物分泌出酵母细胞并在适当部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物③终止序列的影响：终止序列保证了转录产物在适当部位终止和加上polyA尾巴，这样形成的mRNA才能比较稳定并被高效翻译3）外源蛋白的糖基化：N-糖苷键、O-糖苷键,（4）宿主菌株的影响：①菌体生长能力强②菌体内源蛋白酶较弱③菌株性能稳定④分泌能力强,,酵母系统表达的优点：,（3）某些酵母表达系统具有外分泌信号序列,能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外,因此很容易纯化。
1）酵母生长繁殖速度迅速,能够耐受较高的流体静压,用于表达基因工程产品时,可以大规模生产,有效降低了生产成本2）酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力,收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰,性质较原核表达的蛋白质更加稳定,特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质 解决内部降解的方法：（1）在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物,通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用（2）将培养基的pH 值调成酸性(酵母可在pH 3. 0 ～ 8. 0 的范围内生长) ,以抑制中性蛋白酶的活性;（3）利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达酵母表达系统的不足之处：（1）产物蛋白质的不均一（2）信号肽加工不完全（3）内部降解（4）多聚体形成等,造成表达蛋白质在结构上的不一致5）还时常遇到表达产物的过度糖基化情况利用酵母菌表达外源基因的策略,（1）增加整合在酵母染色体上的目的基因剂量（2）控制外源基因中的AT 含量 （3）选择最为合适的信号肽（4）外源基因在酵母菌表达的影响因素还有很多, 如整合位点、mRNA 5′和3′非翻译区(U TR) 、宿主菌的Mut 表型、蛋白酶、表达蛋白质自身的特点、培养基及培养的环境条件等,有效控制各种影响表达的因素,对于外源基因的高效表达都必不可少。
用酵母表达系统(宿主--载体系统),（1）酿酒酵母( S accharomyces cerevisiae) ：难于高密度培养,分泌效率低,几乎不分泌分子量大于30 kD 的外源蛋白质,也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化,而且表达蛋白质的C 端往往被截短2）甲醇营养型酵母表达系统：包括汉森酵母属( Hansenula ) , 毕赤酵母属 ( Pichia) ,球拟酵母属( Torulopsis) 等,能在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长,甲醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶, 如醇氧化酶Ⅰ (AOX1) 等3）裂殖酵母( Schizogenesis pombe) 表达系统：具有许多与高等真核细胞相似的特性,它所表达的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和活性，但目前研究较少1）将目的基因克隆入酵母表达载体（2）用适当的限制性内切酶消化重组质粒,使之线性化（3）将线性化的重组质粒转化入酵母菌株(如GS115 , KM71)（4）将转化物接种HIS4 缺陷平板进行第一轮筛选（5）用不同浓度的G418 平板进行第二轮筛选（6）挑选10～20 个克隆进行小规模诱导培养,鉴定外源基因的表达量（7）挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养,以制备外源基因的表达蛋白质。
用酵母菌表达外源基因的步骤,一、酿酒酵母：单细胞真核微生物，被称为真核生物中的“大肠杆菌”， 最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌1981年用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后， 人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白一）酿酒酵母表达系统组成,（1）YIp型载体：整合型载体，不含酵母DNA 复制起始区，不能在酵母中进行自主复制，含有整合介导区，此载体整合到染色体上，稳定性高，缺点为拷贝数低解决措施：用酵母转座子以产生多个插入拷贝；将re-DNA插入到核糖体rDNA中，在宿主染色体上以150 串联重复序列存在1、载体,（2）YEp型载体：附加型载体，含有酿酒酵母2μ 质粒DNA 复制有关的部分或全部序列, 常以30 或更多拷贝存在，但不稳定,能独立于酵母染色体之外复制，为穿梭质粒不稳定解决措施：以脆弱的srbl-1 突变的宿主株为基础建立自然选择系统, 这个菌株要求渗透压稳定，否则会裂解，转化后带野生型SRB 的自主复制YEp 型质粒与此菌株进行互补，可在培养基上保持选择性2、宿主菌—酿酒酵母,酿酒酵母基因组序列早在1996 年就完成，它有16 条染色体，约6000 个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。
二）酿酒酵母基因表达系统研究现状,目前利用酿酒酵母为宿主系统表达了多种外源基因产物，如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素等外源基因可在酿酒酵母中分泌表达，通常为将重组蛋白的成熟蛋白形式与结合信息素的pre-pro 序列融合，pro 序列可用Kex2 酶的蛋白水解作用切去，这个步骤是广泛存在于真核生物中的，表达产物分泌至胞外不仅有利于纯化，而且避免了产物在胞内大量蓄积对细胞的不利影响 第一个商品化的重组疫苗来自酿酒酵母三）酿酒酵母表达系统高效表达的策略,（1）转录水平（2）表达载体的拷贝数和稳定性（3）胞内表达产物的加工和修饰（4）分泌表达产物的加工和修饰等等四）酿酒酵母表达系统的应用及前景,利用酿酒酵母表达系统生产制备外源基因的表达产物已有20 余年的历史，但实践中仍然发现有很多的外源基因不能在酵母表达系统中表达，具体原因目前还没有明确 另外，还没有彻底克服酵母表达系统制备外源蛋白质时发生的不均一现象二、甲醇营养型酵母,（1）能利用甲醇作唯一碳源的一类酵母,其代谢甲醇的第一步是在醇氧化酶的作用下甲醇被氧化成甲醛，调节这种酶的启动子是强启动子并严格受甲醇诱导,因此可用于调控外源蛋白表达。
2）甲醇酵母能在无机盐培养基中快速生长,易进行工业化大生产,高密度培养干细胞量可达100g/ L以上，外源蛋白的表达量比酿酒酵母增加10- 100 倍3）能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、正确的折叠和修饰,糖基化也更接近高等真核生物甚至人类4）Pichia pastoris 、Pichia methanolical 、Hansenula polymorpha、Candida biodinii 等甲醇酵母已发展成为高效的表达系统, 已成功表达了多种重组蛋白并显示出巨大的优越性，成为目前基因表达优先考虑的表达系统①具有强有力的、易控制的AOX启动子,可严格调控外源蛋白的表达; ②可对表达蛋白进行翻译后加工和修饰,即二硫键的形成、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、N-糖基化、O-糖基化,从而使表达出的蛋白具有生物活性; ③对营养要求低,生长快, 培养基廉价,便于工业化生产; ④可高密度发酵培养,蛋白产量高; ⑤表达量高,如破伤风毒素C 片段表达量高达12 g/ L; ⑥甲醇酵母自身分泌的背景蛋白少,表达产物较易纯化,表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌至胞外,如表达的重组水蛭素(HIR) 仅经过两步层析纯化,纯度就高达97 %以上; ⑦糖基化程度低,和酿酒酵母相比,甲醇酵母中加到翻译蛋白的糖链每条长度为8～14 个甘露糖残基,较之酿酒酵母(50～150 甘露糖残基) 短得多。
此外,酿酒酵母核心多糖末端存在α-1 ,3 糖苷键,使这些蛋白具有高度的抗原性,因而不适宜作治疗制剂,而甲醇酵母没有甲醇酵母表达系统的优点,（1）缺乏葡萄糖、甘油时, 利用甲醇为惟一碳源2）甲醇在乙醇氧化酶作用下被氧化成甲醛,在过氧化物酶体中氧化成H2O23）乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱,因此代偿性地大量产生该酶,调控这种酶的启动子是强启动子,可用来调控异源蛋白的表达两种乙醇氧化酶(即AOX1 和AOX2) ,细胞中绝大多数乙醇氧化酶的活力是由AOX1提供一）巴斯德毕赤酵母,1、生物学特性,（4）当aox1 基因缺失只存在aox2 时,大部分的乙醇氧化酶活力丧失,细胞利用甲醇能力降低,细胞在甲醇培养基上生长很慢,这种菌株被称为Muts (Methanol utilization slow) ; aox1 基因存在时,细胞利用甲醇能力正常,在甲醇培养基上生长较快,这种菌株表型被称为Mut + 5）aox1 基因的表达为转录水平调控aox1 基因的调控是一个抑制机制加上诱导机制的过程,在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时抑制转录,而在以甲醇为惟一生长碳源时诱导基因转录,蛋白质表达6)甲醇酵母生长适宜温度一般为28～30 ℃。
诱导期间如果温度超过32 ℃,不利于蛋白表达,甚至会导致细胞死亡2、载体：主要是可以整合到酵母基因组中的整合型质粒,其主要元件包括启动子,信号肽,多克隆位点,终止子,选择标志,以及可以诱导基因发生重组的同源序列和在大肠杆菌中的复制起点及抗药性基因含有AOX1 基因序列的表达载体既可以在酵母基因组AOXl 或HIS4 位点发生单交换,插入到酵母基因组中;也可以发生双交换而取代AOX1 基因,相应的表现型分别为Mut + 和MutsAOX1区的整合包括同源双交换引起的基因置换和位点特异性单交换引起的基因插入前者使染色体AOX1基因被外源基因表达盒替换,Mut + 表型菌株会转变为MutS 或Mut - ,而MutS 和Mut - 菌株表型不变;后者不改变宿主原有的AOX1 基因,故各种菌株的Mut 表型不变HIS4 区的整合方式为位点特异性单交换表达载体向HIS4 区或AOX1 区的整合赋予宿主菌野生型组氨醇脱氢酶基因,使其表型由HIS - 变为HIS + ,可以此筛选转化子1）启动子,AOXl 启动子(PAOX1)和甘油醛三磷酸脱氢酶(GAP) 启动子PAOX1：受甲醇的严格调控,在碳源为非甲醇的条件下,AOX1 基因转录的mRNA 检测不到,但在甲醇为唯一碳源的培养基中,AOX1 基因编码的mRNA 可达到总RNA 的5 % 。
在PAOX1调控下表达外源基因时可通过调节甲醇而适时地控制表达过程,这样可以有效地减轻选择压力, 保证外源基因的稳定存在。