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1、第十六章 抗生素类药物的分析,药物分析教研室,1,Contents,2,第一节 概述,在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称,定义,3,4,抗生素药物的分类,5,6,7,抗菌药物的主要作用部位,8,细菌的耐药机制,9,细菌的耐药机制,产生钝化酶使抗菌药物失效 药物作用靶位的结构和数量改变抗菌药不易与细菌结合 主动外排机制药物被泵出菌体外,10,产品稳定性差,分子结构大多不稳定，降解后疗效下降、失效或增加毒副作用,发酵过程不易控制易受污染,生产工艺复杂,发酵液中杂质,无机盐、脂肪、各种蛋白质、各种降解产物、色素、热原、毒性物质,抗生素质量的复杂性,11,
2、鉴别：理化方法(主要方法)、微生物法 官能团的显色反应，如：-内酰胺环的羟肟酸铁反应；链霉素的麦芽酚反应、坂口反应； 光谱法：红外光谱及紫外吸收光谱的鉴别。 色谱法：HPLC和TLC法，采用标准品对照品对照法； 生物学法：比较抑菌能力，现已少用。,抗生素质量分析,12,检查： 影响产品稳定性的检查项目：结晶性、酸碱度、水分或者干燥失重等 控制有机和无机杂质的项目：溶液澄清度与颜色、有关物质、残留溶剂、炽灼残渣、重金属等； 与临床安全性有关的检查项目：异常毒性、热源或细菌内毒素、降压物质、无菌等,13,效价：每毫升或每毫克中含有某种抗生素的有效成分的多少。由单位（u）或微克（g）表示。 各种抗生
3、素的效价基准是人们为了生产科研方便而规定的。 1mg青霉素钠定为1670单位；1mg庆大霉素定为590单位。 相应的盐可以通过分子量与标准盐类进行换算。,抗生素活性表示方法,14,含量/效价测定： 微生物法：与临床疗效吻合,灵敏度高，结果直观，适用范围广；但操作复杂费时，误差大 理化方法：准确度与专属性较高, 且操作简便；但与临床疗效有偏差,15,第二节 内酰胺类,氢化噻唑环,氢化噻嗪环,16,第二节 内酰胺类,青霉素(苄青霉素) (penicillins),氨苄西林,阿莫西林,17,第二节 内酰胺类,头孢氨苄,头孢拉定,头孢羟氨苄,头孢噻吩钠,18,第二节 内酰胺类,1.酸性（羧基） pKa
4、 2.5-2.8，酸性较强。碱金属盐水溶性好，有机碱盐难溶于水。,2.手性C （旋光性）,19,第二节 内酰胺类,3.UV,青霉素类：苯环取代基 头孢菌素类：母核有共轭结构,20,4. 内酰胺环(四元环张力+酰胺键 ),第二节 内酰胺类,干燥条件较稳定，溶液不稳定,某些氧化剂、金属离子、温度,21,第二节 内酰胺类,22,第二节 内酰胺类,23,第二节 内酰胺类,(三)呈色反应,1）羟肟酸铁反应内酰胺环,2）类似肽键（-CONH-） a.茚三酮反应-氨基,24,第二节 内酰胺类,b.双缩脲反应内酰胺类,25,第二节 内酰胺类,3）其他呈色反应,（偶合）,青霉素钾和青霉素钠呈红棕色,(四)各种盐
5、的反应 焰色反应K+、Na+,26,第二节 内酰胺类,(聚合物、有关物质、异构体等),1.聚合物,头孢他啶中聚合物测定分子排阻色谱 凝胶色谱分子筛机制,主成分自身对照法 面积归一化法 限量法 自身对照外标法,萄聚糖凝胶 立体网状结构图,27,第二节 内酰胺类,2.有关物质与异构体,头孢呋辛酯中有关物质和异构体的检查,取本品适量，精密称定，加流动相制成约含0.25mg/ml的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加流动相制成2.5 g/ml的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20l注入液相色谱仪，调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%，再取供试品溶液和对照品溶液各20l，分别注入液相色谱
6、仪，记录色谱图至主峰保留时间的3.5倍，供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，其中E异构体峰面积不得大于对照溶液主峰面积之和(1.0%)，3-异构体峰面积不得大于1.5倍(1.5%)，其余单个杂质峰面积的和不得大于3倍(3.0%)。(供试品溶液中任何小于对照品溶液主峰面积之和0.05倍的峰可忽略不计),28,青霉素钠(钾)的吸光度检查： 本品加水制成每1mL含有1.80mg的溶液，照UV-Vis法，在280nm波长处测定吸光度，不得大于0.10；在264nm波长处有最大吸收，吸光度应为0.80-0.88. 该法264nm处吸收值用来控制青霉素钠(钾)的含量，280nm处吸收值用来控制杂质
7、的含量。,3.UV,第二节 内酰胺类,29,第二节 内酰胺类,4.有机溶剂：用GC法或者HPLC法,5.结晶性,30,碘量法 汞量法 酸碱滴定法 羟肟酸比色法 HPLC法,第二节 内酰胺类,31,阿莫西林克拉维酸钾片,色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钠7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至4.40.1，加水稀释至1000ml)-甲醇(95:5)为流动相；流速为0.7ml/min；检测波长为220nm。阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5,测定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水适量，振摇使
8、溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10l注入液相色谱仪，记录色谱图；另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉维酸0.25mg的混合溶液，同法测定。按外标法以峰面积分别计算供试品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。,第二节 内酰胺类,32,第三节 氨基糖苷类,碱性环己多元醇+氨基糖苷,链霉素 (Streptomycin),33,巴龙霉素 (paromomycin),D-葡萄糖胺 脱氧链霉胺,巴龙胺,D核糖 巴龙霉糖,巴龙二糖胺,第三节 氨基糖苷类,34,庆大霉素 (G
9、entamycin),35,1）溶解度（氨基、羟基）：水溶性 2）碱性（氨基）：临床应用其硫酸盐；溶于水，但不溶于有机溶剂； 3）旋光性（糖）：多个手性碳 4）稳定性（苷）：强酸、碱条件均可水解；临床使用时对pH值有很高的要求； 5）紫外吸收光谱,第三节 氨基糖苷类,36,1.茚三酮反应羟基胺类,-氨基酸,第三节 氨基糖苷类,37,2. Molisch 试验 五碳糖或六碳糖结构,a.-萘酚,b.萘酮,蓝紫色,第三节 氨基糖苷类,38,3. N-甲基葡萄糖胺反应（Elson-Morgan反应）,红色,第三节 氨基糖苷类,39,4.麦芽酚反应链霉糖特有反应,H+,第三节 氨基糖苷类,40,紫红,麦
10、芽酚,41,5.坂口反应链霉胍特有反应,42,坂口反应,麦芽酚反应,N-甲基葡萄 糖胺反应,第三节 氨基糖苷类,43,6.硫酸盐反应 7.色谱法：TLC和HPLC法 8.光谱法：IR、UV,第三节 氨基糖苷类,44,1.链霉素中链霉素B（甘露糖链霉素）的检查,来源：发酵中产生,方法：TLC中的对照品法,2.硫酸奈替米星中西索米星的检查(TLC),3.庆大霉素C组分的测定,第三节 氨基糖苷类,45,微生物检定法 平行反应，检测同等量下供试品和对照品对微生物的抑制作用； 管碟法：利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品和供试品对菌群产生的抑菌圈大小； 浊度法：通过抗生素在液体培养基中对细菌生
11、长的抑制作用，通过测定培养后细菌浊度值的大小，比较标准品和供试品抑菌程度，测定供试品效价； -该法优点：灵敏度高、量少、直观；与临床要求一直；使用范围广；是效价测定的最基本方法；目前分子结构复杂、多组分抗生素，首选该法测效价。 -该法缺陷：操作步骤多，时间长，误差大。,第三节 氨基糖苷类,46,HPLC法 有紫外吸收紫外、荧光检测器 无紫外吸收衍生化； 电化学检测器或蒸发光散射法,第三节 氨基糖苷类,47,第四节 四环素类,A,B,C,D,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,四个并苯或萘并萘,48,1）两性： -OH酸性 N(CH3)2碱性,Ca2+、Mg2+生成不溶性盐；F
12、e3+形成红色配合物； Al3+形成黄色配合物 ；pH3 7.5 多价阳离子与酚二酮荧光,与酸、碱均可成盐； 临床多用盐酸盐； 强酸或强碱中溶解度,2）旋光性 3）与金属离子络合(酚羟基、烯醇基),第四节 四环素类,49,4）UV和荧光,盐酸土霉素 经酸或碱降解，呈绿色荧光，加热转为蓝色； 盐酸金霉素 经碱降解，呈蓝色荧光； 盐酸四环素 经碱降解，呈黄色荧光。 可区别不同四环素类抗生素,50,弱酸性（pH2-6） A环C-4异构化 差向四环素 酸性（pH 2） C环脱水 脱水四环素 碱性 C环开环，形成内酯 异四环素,5）不稳定性,A.差向异构化,蓝色荧光,淡黄黑,第四节 四环素类,51,（氢
13、键，土霉素、多西环素不易差向异构化）,第四节 四环素类,52,B.酸性脱水降解,max = 445nm,max = 435nm,第四节 四环素类,53,C.碱性脱水降解,OH-,第四节 四环素类,54,1、HPLC,2、TLC (正相分配薄层色谱),薄层板中加入EDTA克服痕量金属造成的拖尾现象,3、IR,4、UV：最大吸收波长和制定浓度下的吸光度；,5、显色法,浓硫酸 三氯化铁,第四节 四环素类,55,56,1.有关物质HPLC,2.杂质吸光度UV,淡黄色黑色,脱水四环素 橙红色 差向脱水四环素 砖红色,第四节 四环素类,57,第五节 高分子杂质的检查,高分子杂质：药物中分子量大于药物本身的
14、杂质的总称，10005000Da。与过敏反应有关。,58,1.基本结构,第五节 高分子杂质的检查,59,2.特点,（1）生产工艺中产生杂质 发酵中产生 （2）降解 （3）以异构体存在样品，同聚和异聚反应可同时发生。 （4）高分子杂质的种类、数量与生产工艺密切相关（溶媒结晶、喷雾干燥）,第五节 高分子杂质的检查,60,3.杂质控制方法,反相高效液相、离子交换色谱和凝胶色谱。 葡聚糖凝胶SephadexC10,自身对照外标法,第五节 高分子杂质的检查,61,本章小结,抗生素的定义、特点及分类 -内酰胺类结构、性质、呈色反应 氨基糖苷类代表药、结构、性质、鉴别试验 四环素类结构、性质（不稳定性） 高分子杂质定义、来源、分类,62,
