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1、第一军医大学 硕士学位论文 JAK/STAT信号通路在谷氨酸诱导的PC细胞凋亡中的作用 姓名：魏继鹏 申请学位级别：硕士 专业：神经病学 指导教师：刘振华 20070518 硕士学位论文 J A K S T A T 信号通路在谷氨酸诱导 的P C I 2 细胞凋亡中的作用 硕士研究生：魏继鹏 导师：刘振华教授 摘要 近年的研究表明，脑缺血、脑出血、癫瘸、脑外伤、缺氧性脑病，神经系 统变性及退行性交等神经系统疾病均具有某些相似或共同的生理病理机制，均 存在细胞坏死和凋亡。有效的干预神经细胞凋亡进程是当今神经病学研究的重 点，也将是今后治疗的重点。 中根系统的许多疾病的发病机制与谷氨酸( G l
2、u ) 的内源性兴奋性毒性作用 有关，兴奋性氨基酸的毒性作用能诱导神经细胞凋亡。钙离子大量内流，活性 氧( R o S ) 生成增多，水肿，乙酰胆碱受体，腺苷受体A l ，神经肽Y 受体等均 参与了G l u 释放的调节，这些因素可直接损伤细胞膜，破坏所有膜结构，造成 一系列细胞的功能紊乱。G l u 释放涉及多个环节和多种机制，因此抑制G l u 释放 可以对抗脑损伤对引起的神经元损伤。 J A 科S 1 - A T 信号转导通路是一条应激反应通路，广泛参与细胞的增殖、分化 成熟、凋亡以及免疫调节等过程，是众多细胞因子信号转导的重要途径之一。 在不同的疾病中所起的作用不致，那么，在神经细胞凋
3、亡或坏死时是否可以上 调和活化J A K 、S T A T 蛋白以及J A U S T A T 的激活作用是什么? 本文展开了以下 的研究工作。 中文摘要 第一部分谷氨酸诱导的P C I 2 细胞凋亡模型确立 研究目的：探讨谷氨酸诱导P C I 2 细胞凋亡的浓度及作用时间 研究方法： I P I 染色流式细胞仪( F C M ) 检测P C I 2 凋亡 2 H o e h e s t 染色检测P C I 2 细胞凋亡 研究结果： 1 谷氨酸引起P C I 2 细胞5 0 左右凋亡浓度的确定： 用1 0 0 2 0 0 0 u m o l L 的谷氨酸处理P C I 2 细胞，引起P C I
4、 2 细胞的凋亡具有剂 量依赖性的关系。不同剂量的谷氨酸处理2 0 m i n 的结果显示： 1 0 0 、2 0 0 、 3 0 0 u m o t L 谷氨酸作用2 0 m i n ，凋亡率分别为( 3 ，2 0 - 士0 3 7 ) 、( 4 5 f f a ：0 2 9 ) 、 ( 4 5 0 士O 8 8 ) ，与证常组对照没有引起P C I 2 细胞明显的凋亡( P 0 0 5 ) ； 5 0 0 u m o l L 谷氨酸作用2 0 m i n ，凋亡率增加到( 6 1 2 0 - a ：4 6 0 ) 、与【F 常组P C I 2 细胞凋亡率对比有明显的统计学差异( P 0 0
5、 5V S c o n t r 0 1 ) ；b u tt h et r e a t m e n tw i t h5 0 0p m o l LG l u t m a t ei n d u c e ds i g n i f i c a n t c h a n g e s i nt h e a p o p t o s i s o fP C I 2c e l l s ，t h e p e r c e n t a g e o f a p o p t o s i sw a s ( 6 1 2 0 士- 4 6 0 ) ( p 0 0 5 ( 砰3 ) 2 3 - 1 DE 缅豳o f A G - 4 9
6、 00 1 1 镧袖0 fP - J A K 2 ：* G h v 2 0 卿谁D M S O + G l u - 2 0 擘呻P _ o 0 5 ；群：A G 枷G h l - 2 0 9 n m p + w C d u - 2 0 9 m u p P 蛐0 5( D 如a _ e m a m s 士S D n = 3 ) 4 1 5 5 5 3 5 2 5 l 5 O 毛 互 L 仉 ，鼍米矗皂草戗呈-d D峰枨茁逛基趔撼鬟蓉鐾，& 第二部分J A K S T A T 信号通路在谷氨酸诱导的P C t z 细胞凋亡中的作用 2 3 2 谷氨酸处理上调P S t a r 3 的表达 J A
7、K 2 激活能否引起S T A T 3 的激活，实验样本于5 0 0 t t m o l L 的谷氨酸处理后 5 r a i n 、l O m i n 、1 5 m i n 、2 0 m i n 、3 0 m i n 及6 0 m i n 收集。W e s t e r nb l o t 结果显示，谷 氨酸处理诱导了P - S T A T 3 蛋白的表达，在处理1 5 m i n 时P S T A T 3 表达增强，持 续到6 0 r a i n ，3 0 m i n 达高峰，为5 m i n 组的( 4 7 6 a ：0 1 7 ) 倍，各时间点P S T A T 3 表达量经单因素方差分析结
8、果显示有显著性差异( F = 1 0 1 1 4 ，P = 0 0 0 0 ) ，用L S D 方法进行多组问多重比较，结果显示：5 0 0 u m o i L 谷氨酸、作用2 0 r a i n 组与5 m i n 组相比有显著性统计学差异( P = 0 0 0 0 ) 。以上变化，可被J A K 2 的特异性拮抗 剂A G 4 9 0 ( 1 0 u m o l l L ) 所抑制，谷氨酸作用2 0 r a i n 组是拮抗剂组的( 3 3 1 4 - _ 0 2 4 ) 倍；各组P - S T A T 3 蛋白表达量经单因素方差分析结果显示有显著性差异 ( F = 1 2 4 ，P =
9、0 0 0 0 ) ，用L S D 方法进行多组间多重比较，结果显示：5 0 0 u m o l L 谷氨酸、作用2 0 m i n 组与5 m i n 组相比有显著性统计学差异( 户= O 0 0 0 ) ，而 D M S O + 5 0 0 u m o l l 谷氨酸作用2 0 m i n 组与5 0 0 u m o l l 谷氨酸作用2 0 m i n 组比较， 两者无统计学差异( P - - - O 7 2 4 ) ；以上结果说明谷氨酸处理激活了J 舢( 2 S T A T 3 信 号通路。各组数据见图2 3 2 B 和2 3 2 D 。 硕士擘位论文 ； ： 毕 ；I 1I 章 e
10、4 m t r o l ! Q! !垫垫 鲤 t i ma f t e r5 0 0 m o l LG i u “i 日) 时甸矗分组 c a t t r o l 朋6 U + 6 I t 邪 6 1 m - 2 0 5 佣O + G l P 2 0 备处理闪索分组 图2 3 - 2 B 不同时间点P - S T A T 3 的表达情况：与5 m i n 组比较P O 0 5 ；# 与3 0 m i n 组比较P 0 0 5 ( 闻) 图2 3 2 DA G - 4 9 0 对S T A T 3 表达的影响撑与5 0 0 n m o l l 谷氨酸作用3 0 r a i n 组比较P O 0
11、5 ( n - 3 ) F i g2 3 - 2 BG h a m a t e - i n d u c e d 啪嘲r a p i de x p r e s s i o na n dt y m s i n ep h o s p h o 聊a t i o no f S T A 3 B ：P 哪0 5 V S 5 m i n g r o u p ：1 0 m i n g r o n p v s 5 m i n g r o u p P 0 0 5 # ：2 0 r a i n g r o u p V S 3 0 m i n g r o u pP 0 0 5 ( 衅_ 3 ) F i g2 3 - 2
12、 DE f f e c t so f A G - 4 9 00 1 1a 叩f s i o fP - S T A T 3 ：G l u - 2 0g r o u pw D M S O + G I u - 2 0g r o u pP O 0 5 ；# ：A G - 4 9 0G l u - 2 0g r o u p + ”G i u - 2 0g r o u pP 0 0 5 ( D a t am m e t a l s 士 S D n = 3 ) 2 3 3J A K 2 特异抑制剂A G - 4 9 0 对谷氨酸处理的细胞损伤作用的影响 为了从形态学的角度直接观察P C I 2 细胞受损情况
13、，以及谷氨酸处对其凋亡 B峰枨缸鉴皇童譬坷璺 3 2 l n D皤状茁在孥琶幕最鼍工v工s-d 第二部分J A K S T A T 信号通路在谷氨酸诱导的P C 。：细胞凋亡中的作用 的影响，对各实验组细胞进行了核染色。根据实验方案，P C I 2 细胞经5 0 0 u m o l L 的谷氨酸处理2 0 m i n 。经h o c h e s t 3 3 2 5 8 染色，荧光镜下观察细胞内D N A 形态， 结果发现，对照组P C I 2 细胞染色质分布均匀，为弥漫均匀的低强度荧光 ( F i v E 3 3 A ) ；经5 0 0 u m o l L 谷氨酸处理2 0 m i n 后P
14、C I 2 细胞呈现典型的凋亡特 征：大量的细胞核呈浓缩致密的固缩形态或颗粒状荧光( F i 9 2 3 3 B ) ；在 5 0 0 u m o l L 的谷氨酸处理前2 0 m i n 给予J A K 2 的特异性抑制剂A G - 4 9 0 ( 1 0 u m o l L ) ，町以明显阻断谷氨酸所致的损伤作用，起抗凋亡作用，其中细胞核 呈浓缩致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞明显减少( F i 9 2 3 3 C ) ； 硕士擘位论文 C ( 2 0 0 ) 图2 3 3 ：h o c h e s t 荧光染色法观察A G - 4 9 0 对谷氨酸诱导细胞凋亡的影响。 A ：对照组；
15、B ：5 0 0 u m o F L 谷氨酸作用2 0 m i n 组；C ：A G 4 9 0 + 5 0 0 u m o F L 谷氨酸作 用2 0 r a i n 组 F i 9 2 3 - 3N u c l e a r 武a i n 缸ge a a l y s i s f o rf i l eo fA G - 4 9 0 蛐l h ea p o p t m i si n d u c eb y g l u l m a t e N u c l e q rc o n d e m a t i o gw a sa s s e s s e dw i t hH o c h e s t3 3 2 5
16、8 Ac o n t r o l ；BP C I 2c e l l s , t r e a t e d w i m5 0 0 u m o l Lg h n m a tf o r2 0 m i n , m a r k e d l ya p p e a r e da p o p t o 缸n u c l e a rc o n d e n s a f i o n ；C t h e n u m b e r o f P C I 2c e l b w i r e n u c l e a r c o n d e n s a t i c n o b v i o u s l y d c c r e a , i a f t e r l , r e c o n 础o n m gw i 血 A G - 4 9 0 a t1 0 u m
