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1、无能T 淋巴细胞的建立及其免疫生物学特性的研究 =摘要 目的 探讨体外诱导 T 淋巴细胞无能的条件, 并分析无能 T 淋巴细胞的免疫生物学特性。方法 以 Wi star大鼠的脾细胞为刺激细胞, SD大鼠的脾细胞为反应细胞,进行混合淋巴细胞反应( MLR) ,分别单独或联合加入剂量不等的抗 B7 21 单克隆抗体(抗B7 21 单抗)、 抗 B7 22 单克隆抗体(抗B7 22单抗) , 制备无能 T 淋巴细胞。将无能 T 淋巴细胞和刺激细胞混合,分别加入抗 CD3 单克隆抗体、刀豆蛋白(Con A)及白细胞介2( IL22) , 分析各种情况下无能 T 淋巴细胞的增殖情况; 将刺激细胞与同种异
2、体 SD大鼠脾细胞混合, 分别加入不同数量的无能 T 淋巴细胞, 分析 SD大鼠淋巴细胞的增殖情况。结果 单独应用抗 B7 21单抗或抗 B7 22 单抗, 对淋巴细胞增殖的抑制作用不明显,而将二者联用,能明显阻断 T 淋巴细胞增殖; Co n A及 IL 22 能使无能 T 淋巴细胞增殖, 而抗 CD3 单克隆抗体不能使无能 T淋巴细胞发生增殖;无能 T 淋巴细胞对同种异体 T 淋巴细胞的增殖也产生抑制作用, 该效应具有抗原特异性。结论 联合抗 B7 21 单抗和抗 B7 22单抗可诱导 T 淋巴细胞无能; 无能 T 淋巴细胞在体外呈免疫无反应性,并能抑制同种异体 T 淋巴细胞的增殖,该抑制
3、作用具有抗原特异性。=关键词 免疫耐受;抗体, 单克隆;表位; T 淋巴细胞; 淋巴细胞培养试验,混合T 淋巴细胞是介导排斥反应的主要淋巴细胞 1, 它的激活、 分化和增殖在免疫应答中起关键作用,因此,诱导抗原特异性 T 淋巴细胞的长期无反应状态具有重要意义。T 淋巴细胞无能是 T 淋巴细胞产生免疫耐受的主要机制之一2, 无能是指T 淋巴细胞的功能性无反应或失活, 而不伴有细胞死亡3。我们联用抗B7 21 单克隆抗体(抗B7 21 单抗)和抗B722 单克隆抗体(抗 B722 单抗)阻断B7/CD28共刺激途径,在体外诱导 T 淋巴细胞无能, 并分析其体外免疫生物学特性, 从细胞水平上探讨无能
4、T 淋巴细胞诱导免疫耐受的作用机制,以期建立持续、 稳定的移植耐受状态。材料和方法一、 材料1. 动物: Wistar 大鼠及 SD 大鼠, 鼠龄 8 10周,雄性, 体重150 180 g, 由中山大学实验动物中心提供。以Wistar大鼠的脾细胞作为刺激细胞, SD大鼠的脾细胞作为反应细胞。2. 主要试剂: 纯化的功能阻断性小鼠抗大鼠B721(CD80)单克隆抗体、 抗 B7 22( CD86)单克隆抗体和小鼠抗大鼠CD3 单克隆抗体(抗CD3 单抗)均为BD生物科学公司产品; 促有丝分裂原刀豆蛋白A( Con A)、 丝裂霉素C(MMC)及大鼠重组白细胞介素2( IL22)均为Sigma公
5、司产品;红细胞溶解试剂盒购自R&D systems 公司;细胞增殖分析试剂盒购自Chemicon 国际公司;淋巴细胞分离液(密度1. 077g/ cm3)由上海恒信化学试剂有限公司生产。二、 方法1. 大鼠脾细胞悬液的制备: 参见文献 4。收集脾细胞后,用红细胞溶解试剂盒去除红细胞,调整脾细胞浓度为( 0. 5 1. 0) 107/ ml。2. Wistar大鼠刺激细胞的制备:参见文献 5。3. 抗B7 21 单抗和抗B7 22 单抗对T 淋巴细胞增殖的影响: 将刺激细胞和反应细胞(均为 4 105个/孔)加入 96 孔板混合, 200 Ll/孔,按所加抗体的不同分为4 组: ( 1)抗B7
6、21 单抗组,各孔分别加入不等量的抗 B721 单抗, 使其终浓度分别为0. 001、0. 01、 0. 1、 1、 10 Lg/ ml; ( 2)抗B7 22 单抗组, 各孔加入不等量的抗 B722 单抗,其终浓度同抗B7 21 单抗组; ( 3)抗B721 单抗与抗 B722 单抗联用组, 各孔按上述终浓度加入两种单抗; ( 4)不加单抗组, 为对照组。以上每种条件设 3 个复孔,均在37 e 、 含体积分数为 5 % CO2 的培养箱中孵育3 d 后,用细胞增殖分析试剂盒分析反应细胞的增殖情况(以其在480 nm 波长下的吸光度 A 值表示,下同)。4. 无能T 淋巴细胞的制备: 将刺激
7、细胞与反应细胞(均为4106个/孔)加入12 孔板中混合, 用完全RPMI 1640 液重悬成3 ml/孔,再加入抗B721 单抗和抗B722 单抗各30 Lg(终浓度均为 10 Lg/ ml) ,在37 e 、 含体积分数为5 % CO2的条件下培养5 d后,收集细胞,再用完全RPMI 1640 液培养 2 d, 以淋巴细胞分离液收集淋巴细胞, 用RPMI 1640 液洗2 次, 每次1500 r/ min 离心10 min, 弃上清液,所得细胞即为无能T 淋巴细胞。5. 检测无能T 淋巴细胞的增殖能力以鉴定其无能性:将刺激细胞和无能 T 淋巴细胞(均为 4 105个/ 孔)加入96 孔板混
8、合,设3 个复孔,在37 e 、含体积分数为 5 % CO2 的条件下培养7 d,每天分析无能T 淋巴细胞的增殖情况。以新分离的 SD大鼠脾细胞作为对照细胞。6. 无能T 淋巴细胞对同种异体( SD大鼠)淋巴细胞增殖反应的影响: 将刺激细胞( 2 105个/ 孔)与SD 大鼠脾细胞( 1 105个/孔)加于 96 孔板混合, 100 Ll/孔, 每孔加入数量不等的无能 T 淋巴细胞,其与SD大鼠脾细胞的比率分别为0/ 1、 0. 01/ 1、0. 03/ 1、 0. 1/ 1、 0. 3/ 1、 1/ 1、 3/ 1 及1/ 0, 每种条件设3 个复孔, 在37 e 、 含体积分数为 5 %
9、CO2 的培养箱中孵育4 d,分析SD大鼠脾细胞的增殖情况。7. Con A及抗CD3 单抗对无能T 淋巴细胞的作用:将刺激细胞( 2 105个/ 孔)与无能 T 淋巴细胞( 1105个/孔)加于96 孔培养板混合, 一部分加Con A( 2 Lg/ ml ) ,在37 e 、 含体积分数为 5 % CO2的条件下培养 2 d; 另一部加入不等量的抗 CD3 单抗,其终浓度分别为 1、 3、 10、 30、 100 Lg/ ml , 均在37 e 、 含体积分数为 5 % CO2 的条件下培养 4 d。以上每种条件设 3 个复孔。培养结束后, 分析无能T 淋巴细胞的增殖情况。以新分离的 SD大
10、鼠脾细胞为对照细胞。8. IL22 诱导无能T 淋巴细胞/ 复能0: 将刺激细胞和无能T 淋巴细胞(均为1 105个/孔)加入96 孔板中混合, 各孔加入不等量的 IL22, 使其终浓度分别为0、 10、 30 及100 U/ ml,每种条件设3 个复孔,在37 e 、 含体积分数为 5 % CO2 的条件下培养4 d,分析无能T 淋巴细胞的增殖情况。以新分离出的SD大鼠脾细胞作为对照细胞。三、 统计分析所有实验数据均为计量资料,以均数? 标准差表示。用SPSS 10. 0软件进行统计学分析, 采用单因素方差分析结 果一、 抗B721 单抗和抗B722 单抗对 T 淋巴细胞增殖的影响不加单抗组
11、的淋巴细胞增殖明显,而加入抗 B7单抗的三组淋巴细胞增殖受到不同程度的抑制, 但单独应用单抗的抑制作用不明显,两种单抗联用组淋巴细胞增殖受到明显抑制, 且呈一定的浓度依赖性,当两种单抗的浓度均达到 10 Lg/ ml时, 反应细胞的增殖反应可被完全抑制(图1)。图 1 不同浓度的抗 B7 单抗对 T 淋巴细胞增殖的影响二、 无能T 淋巴细胞的增殖情况刺激细胞不能刺激无能 T 淋巴细胞增殖。对照的SD大鼠脾细胞增殖明显, 但由于未继续更换培养液,细胞代谢产物堆积过多,第 4 d 后细胞增殖受到抑制。三、 无能T 淋巴细胞对同种异体淋巴细胞增殖的抑制作用无能T 淋巴细胞可抑制同种异体淋巴细胞的增殖
12、, 当无能细胞与同种异体淋巴细胞的比率为0. 1/ 1时,便显示明显的抑制效应(图2)。四、 Con A对无能T 淋巴细胞增殖的影响与对照的SD大鼠脾细胞( A 值为0. 70 ? 0. 10)一样, Con A能刺激无能 T 淋巴细胞增殖( A 值为0. 79 ? 0. 10)。五、 抗CD3 单抗对无能T 淋巴细胞增殖的影响抗CD3 单抗不能使无能T 淋巴细胞发生增殖,甚至在浓度高达100 Lg/ ml 时也无增殖, 而对照的SD大鼠脾细胞则呈剂量依赖性增殖(图3)。六、 外源性的重组 IL22 逆转无能状态无能状态可被外源性的重组 IL22逆转,当 IL22达到 100 U/ ml 时能
13、完全逆转无能状态(其增殖能力强于新分离出的 SD大鼠脾细胞, 图4)。讨 论T 淋巴细胞完全活化并引起免疫应答(移植排斥)需要两个独立且有协同作用的信号6。第 1 信号通过受体复合物(TCR)传递, 由抗原自身提供,决定免疫应答的特异性; 第 2 信号(共刺激信号)是非抗原特异的, 通过T 淋巴细胞表面受体和抗原递呈细胞(APC)上相应配体传递。免疫反应中二者缺一不可,如果第1 信号缺失或传递受阻,则免疫反应无法进行,而第1 信号正常,第2 信号缺失或传递受阻时,T 淋巴细胞则处于无反应状态, 即为 T 淋巴细胞无能。由APC 上表达的B7 分子( B721 和 B722)及T 淋巴细胞上的
14、CD28 受体组成的 B7/ CD28 是一条重要的T 淋巴细胞共刺激通路, 阻断 B7/ CD28途径能抑制T 淋巴细胞反应和效应过程,导致T 淋巴细胞无能,从而诱导出免疫耐受7。本实验显示, 单独应用一种抗B7 单抗抑制淋巴细胞增殖的作用不明显, 提示抗 B721 单抗或抗B722 单抗仅阻断部分共刺激信号, 这与 Zheng 等8 的实验结果一致。我们以 T 淋巴细胞激活的双信号理论为基础, 依据此浓度( 10 Lg/ ml)联合应用抗B721单抗和抗 B722 单抗, 以混合淋巴细胞反应(MLR)为反应体系,在体外成功诱导T 淋巴细胞无能。我们的实验结果还显示, 刺激细胞不能刺激无能T
15、 淋巴细胞增殖, 表明无能 T 淋巴细胞因 B7/CD28通路被阻断,不能对完整的活化信号起反应,受正常APC和抗原刺激时表现为不能增殖。无能T 淋巴细胞不单是被动无反应的, 且具有主动的抑制作用。许多研究发现, 无能T 淋巴细胞对具有相同抗原特异性的其它 T 淋巴细胞的增殖也具有抑制作用 9, 10。Lombardi 等9发现, 无能 T淋巴细胞能够通过细胞2细胞接触抑制与之具有相同APC特异性的T 淋巴细胞的增殖,进而诱导非无能T 淋巴细胞对特异性抗原的耐受, 形成一种传染性耐受效应。Mannie 等 10发现, T 淋巴细胞在接受无能信号刺激的同时, 获得了抗原递呈活性(T2APC) ,
16、这种T2APC可使T 淋巴细胞产生激活后无能,并用此无能T 淋巴细胞建立了体内传染性耐受模型。我们的体外实验显示, ConA 可刺激无能 T 淋巴细胞增殖,提示无能T 淋巴细胞遇到某些激活因素可以发生增殖反应,但抗CD3 单抗不能促使无能T 淋巴细胞增殖, 这表明无能 T 淋巴细胞通过TCR/ CD3 的信号传导被阻断, 这与Luo 等11的报道一致。加入外源性 IL22 能否使无能 T 淋巴细胞/ 复能0,这是无能T 淋巴细胞最有争议性的一个特性。有学者发现,在体内诱导的无能T 淋巴细胞对IL22 无反应,可能与无IL22 受体A链的高水平表达有关 12, 13。另有学者认为,无能T 淋巴细胞在外源性IL22 作用下可以发生增殖而得以/ 复能0,无能是一种暂时状态, 它的逆转与细胞表面某些分子表达有关
