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1、答 辩 人：关 春 龙,专 业：生物工程,干旱、盐碱胁迫对苗期羊草GSH-Px活性的影响,指导教师：崔 喜 艳,吉林农业大学生命科学学院生物工程专业,目录,前言,羊草（Leymus chinesis）是多年生根茎型禾本科植物，具有无性繁殖能力强、生产力高、耐干旱、耐贫瘠、耐盐碱等生物生态学特性。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH一PX)即谷胱甘肽:H2O氧化还原酶,分子量76009600，是一种水溶性四聚蛋自酶，其四个亚基处在一个平面上，且均有一个硒原子。具有催化活性的硒半胱氨酸位于酶分子178个氨基酸的第35位置上，在酶分子表面凹穴的活性部位，易于接触有机氢过氧化物并使其还原为有机羟化物;GSH一P
2、X也可使H2O2变成H2O，以消除氧化胁迫。还原型谷胱甘肽(GSH)在催化反应中作为氢供体，氧化型谷胱甘肽(GSSG)在谷胱甘肽还原酶(GSSG一R)作用下，还原成GSH。 本研究以不同盐碱化程度及干旱程度下的羊草为试验对象，探讨羊草体内谷胱甘肽过氧化物酶对盐碱和干旱环境的活性，进一步揭示羊草抗干旱、盐碱及适应不同生镜的机制，力求为治理退化草地提供理论依据,1.羊草 2.吉林农业大学生命科学学院生物化学515研究室，RXZ型智能人工气候箱,1. 盆栽砂培 2.人工气候箱培养，出苗前每天上午8:00-8:30分浇去离子水50mm透灌，苗出齐后浇Hoagland营养液，照光时间12h(早7:00-
3、晚19:00)。白天温度为282，夜间温度为162,出苗2周后，每天下午4:00-4:30分，对不同品种分别用盐碱水、PEG 6000处理1.2.3天。每天浇适量的水以补充蒸发耗分。不同时间处理的品种都有对照（CK），单纯用Hoagland全营养液透灌,处理时间到后，选择均匀一致的3盆测定样品，分别剪取叶片，洗净根后液氮速冻，-20冰箱保存备用,2,3,4,6,5,1,1.试验方法 用0. 2 mo l /L pH 6. 2的磷酸缓冲液 ( 含 1 mmo l/L EDTA-2Na，5%的水溶性PVP)作为谷胱甘肽过氧化物酶（GSH一PX）的提取介质，偏磷酸为酶促反应的蛋白质沉淀剂, 二硫代对
4、二硝基苯甲酸 (DTNB ) 与 GSH显色反应3min, 在412 nm测定酶管和非酶管的OD值, 以测定谷胱甘肽过氧化物酶的活性。,测定项目与方法,3,1,6,5,4,2,2. 测定时间 苗期；试验数据采用3个重复的平均值标准差，用DNS软件进行数据分析,测定项目与方法,2,3,1,6,5,4,测定项目与方法,3.试剂的配制 a迭氮钠-磷酸缓冲液（NaN3-PBS，PH7.0）:2.5mmol/L NaN3，0.2mmol/L EDTA-2Na，0.2mol/L Na2HPO4和0.2mol/L NaH2PO4。 b.偏磷酸沉淀夜：含1.67%HPO3，0.05% EDTA-2Na，28%
5、NaCl。 c.0.61mol/L 三氯乙酸（TCA）。 d.0.32mol/L Na2HPO4。 e.1.0mmol/L GSH溶液（当日配制）：3.07mgGSH用NaN3-PBS溶解至10ml。 f.1.5mmol/L H2O2（当日配制）：取30% H2O2 15l，以双蒸水定容至100ml。 g.DNTB显色液：DTNB 20mg加1%柠檬酸三钠50ml溶解,2,3,1,6,5,4,测定项目与方法,4.蛋白质与GSH标准曲线的制作,吸取样品液1.0ml于试管中，加入5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀，放置2min后在595nm下比色测定光吸收度并通过标准曲线查得蛋白质含量。 样品中的蛋白质含
6、量（mg/g）=CVT/VSWF1000 式中：C查标准曲线值，g；VT提取液总体积，ml；VS样品鲜重，g；WF测定时加样量，ml,取上述标液1. 6ml,加0. 32 mol/ LNa2HPO4 2. 0 ml和DTNB 0. 4 m l,显色5min,于412nm比色,同双蒸水调零。以OD值为纵坐标, GSH浓度为横坐标,制标准曲线,2,3,1,6,5,4,测定项目与方法,5.酶液的提取 分别取经盐碱和干旱处理过的新鲜羊草幼苗叶片及根茎，0.5g加入0.2mol/Ld的磷酸缓冲液（含1mmol/L EDTA-2Na，5%的水溶性PV P, pH 6. 2) 5 m l, 冰浴中研磨成匀浆
7、, 4000 r /min离心10min,取上清液于12000 r /min离心5min, 取上清液供酶活力测定用,2,3,1,5,4,6,6.酶活力测定,测定项目与方法,取上述酶液各0. 4 ml,分别注于酶管和非酶管中,并将非酶管加热使酶失活,分别加入1. 0 mmol/ L GSH 0. 4 ml和经37预热的1. 5 mmol /L H2O2 0. 2 ml, 立即于37下反应3min, 再在2支试管中加入1. 67%的偏磷酸沉淀液4. 0 ml, 2000 r/m in离心10 min,保留上清液。另取2支试管分别加入上述清液2. 0 m l;再取1支试管加双蒸水0. 4 m l和1
8、. 67%的偏磷酸沉淀液1. 6 ml作为空白管,并在这3支试管中各加入0. 32 mol/ L Na2HPO4 2. 5ml和DTNB 0. 5 ml, 反应5 min, 在412nm处比色读取OD值。 按下式进行计算: GSH-Px活力（U）= （非酶管OD412-酶管OD412）A6.25/5（min）1ml样液中蛋白质（mg） A=标准GSH（m）/标准GSH（OD412），即标准曲线的斜率;酶活力单位（U），IU=GSH1mol/mg蛋白质min,结 果 与 分 析,干旱胁迫对苗期羊草GSH-Px活性的影响,1,盐碱胁迫对苗期羊草GSH-Px活性的影响,2,干旱胁迫对苗期羊草叶片GS
9、H-Px活性的影响,干旱胁迫对苗期羊草叶片GSH-Px活性的影响规律为：处理三天的GSH-Px活性处理两天的GSH-Px活性处理一天的GSH-Px活性。在同等天数处理的的条件下GSH-Px活性随着PEG浓度的上升而上升。在同等干旱浓度条件下GSH-Px活性随着处理天数的增加而上升,干旱胁迫对苗期羊草根GSH-Px活性的影响,干旱胁迫对苗期羊草根的GSH-Px活性的影响规律为：处理三天的GSH-Px活性处理两天的GSH-Px活性处理一天的GSH-Px活性。处理同等天数的条件下GSH-Px活性随着PEG浓度的上升而上升。在同等干旱浓度条件下GSH-Px活性随着处理天数的增加而上升 同时在同一干旱浓
10、度和处理天数的条件基础上羊草叶片中的GSH-Px的活性要高于根的GSH-Px活性,盐碱胁迫对苗期羊草叶片GSH-Px活性的影响,对苗期羊草叶片GSH-Px活性的影响规律为：处理两天的GSH-Px活性处理三天的GSH-Px活性处理一天的GSH-Px活性。处理同等天数的条件下GSH-Px活性随着盐碱浓度的上升而上升，到达相应盐碱浓度的峰值后随着盐碱浓度的上升而下降。在同一盐碱浓度条件下，羊草叶片GSH-Px活性随着天数的上升而上升，到达相应天数的峰值后随着天数的上升而下降,盐碱胁迫对苗期羊草根GSH-Px活性的影响,盐碱胁迫对苗期羊草根的GSH-Px活性的影响规律为：处理两天的GSH-Px活性处理
11、一天的GSH-Px活性处理三天的GSH-Px活性。处理同等浓度的条件下GSH-Px活性随着盐碱浓度的上升而上升，到达相应盐碱浓度的峰值后随着盐碱浓度的上升而下降。在同一盐碱浓度条件下，羊草根的GSH-Px活性随着天数的上升而上升，到达相应天数的峰值后随着天数的上升而下降。 同时在同一盐碱浓度和处理天数的条件基础上羊草叶片中的GSH-Px的活性要高于根的GSH-Px活性,结 论,通过对羊草谷胱甘肽氧化物酶在盐碱和干旱环境下的活性的研究，可得知，羊草的抗干旱能力要优于其抗盐碱能力。因此可通过人工培育或筛选等方法选出抗盐碱能力高的植株进行培育，并充分利用羊草成苗具有的强大无性繁殖能力和抗盐碱优势，大
12、面积快速建植人工羊草种群，可快速重建盐碱地羊草植被，羊草根茎穿透侵占能力很强，且能形成强大的根网，盘结固持土壤作用很大，对表层土壤起到明显的保水作用，同时改善了土壤的地温条件，有效地控制了水土流失，可改善生态环境，明显是很好的水土保持植物。且羊草产量高，增产潜力大，各类家畜一年四季均喜食。同时本文也为日后羊草等禾本科植物的研究提供了一定的参考。,本文是在崔喜艳老师的指导下完成的。崔老师严谨的治学态度和广阔的科研视野令我受益匪浅，同时也为我营造了一种良好的学术氛围，置身其间，耳濡目染，潜移默化。崔老师在百忙之中多次给予指导并提出宝贵的意见，本文才得以成型。在此再次感谢崔喜艳老师四年来在我的学习上给予的精心指导和热情帮助。 感谢刘忠野等师兄师姐在学习和生活上给予我关心和帮助。 四年来，我的家人也给了我无私的关怀和帮助，感谢他们给我物质和精神上的支持，使我的学历得以顺利完成，他们永远是我前进的动力和源泉。 同时本文参考了大量的文献资料，在此向各学术界的前辈们致敬! 最后，再次向给予我关心和帮助的老师、同学及家人表示最诚挚的谢意！,致 谢,
