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1、弱阳离子交换毛细管整体柱的制备与蛋白质分离摘要：以甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA ）为交联剂，正丙醇、1,4 丁二醇和水为致孔剂，偶氮二异丁腈（AIBN ）为引发剂，在弹性石英毛细管内原位制备了聚合物整体固定相基质。优化得到的最佳反应物组成为GMA：EDMA：正丙醇：1,4-丁二醇：水=0.32 ：0.08：0.35：0.2：0.05，在 60反应 24h,得到了孔径分布在 100 300nm 的大孔型整体固定相。用亚胺基乙二酸对整体柱进行表面改性，制备了弱酸型阳离子交换整体固定相。优化得到的最佳改性条件是：反应时间24h、温度 75 C 和 pH12.0
2、。本研究制备的一根仅 5cm 长的弱阳离子交换毛细管整体柱可以在 13min 内分离 3 种模型蛋白质（粗卵蛋白、胰蛋白酶和溶菌酶） 。关键词：毛细管整体柱，甲基丙烯酸酯，离子交换色谱，蛋白质 1 前言 毛细管整体柱具有制备简单、渗透性好、传质速度快、不用烧塞子和易于改性等优点，近年发展迅速，已在毛细管电色谱和微液相色谱领域得到了广泛应用 1, 2。大量研究证明多孔聚合物基质毛细管整体柱比多孔硅胶基质毛细管整体柱更适合生物大分子的分离 37 。离子交换色谱是蛋白质等离子性生物大分子分离的首选色谱分离模式，但离子交换毛细管整体柱的制备及其用于蛋白质分离的研究还很少。相比于强阳离子交换固定相，弱阳
3、离子交换固定相与生物分子之间的相互作用比较温和，因而不易导致蛋白质变性。Li 等 8制备了丙烯酰胺基质弱阳离子交换毛细管整体柱，Legido-Quigley 等 9开发了聚苯乙烯基质弱阳离子交换毛细管整体柱，均可用于蛋白质的分离。但是，目前报道的弱阳离子交换整体柱通常采用两步法改性，即先用乙二胺处理，再用氯乙酸反应。本研究利用亚胺乙二酸进行一步改性，简化了合成步骤，获得了具有羧酸基团的弱阳离子交换毛细管整体柱，并考察了其对蛋白的分离能力。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 1100 HPLC QuatPump（Agilent，美国） ；CL2001 毛细管电泳 紫外检测器（北京彩陆科学仪器有限
4、公司） ；N2000 色谱数据处理用软件（浙江智达信息工程公司） ；KYKY 2800扫描电镜（中国科学院北京科学仪器研制中心） ；AutoPoreIV9510 汞渗透测孔仪（Micromeritics Inc.，美国） 。 甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）和 - 甲基丙烯酸氧丙基三甲氧基硅烷（ -MAPS）（东京化成工业株式会社，日本） ；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA ，Acros Organics, 美国)；正丙醇和 1,4-丁二醇（北京市化学试剂三厂） ；偶氮二异丁腈（AIBN，天津福辰化学试剂厂，使用前重结晶除杂质） ；亚胺乙二酸(IDA，分析纯) 、粗卵蛋白和溶菌酶（北京世纪华林生物
5、科技有限公司） ；胰蛋白酶（北京拜尔迪生物公司） 。 2.2 毛细管预处理 利用水泵的负压使 0.1mol/L 氢氧化钠、水和丙酮依次通过毛细管，对毛细管内壁进行活化与清洗，然后通入氮气吹干。将 30% -MAPS 的丙酮溶液充满毛细管，密封，在 60水浴内放置 24h。然后用丙酮清洗毛细管，氮气吹干，备用。 2.3 整体聚合物基质的原位合成将单体混合物（0.96mLGMA 0.24mL EDMA)与三元致孔剂混合物（1.05mL 正丙醇0.60mL 1,4-丁二醇0.15mL 水）混合后，加入 12mg AIBN 引发剂，超声震荡 5min 使其充分溶解，然后通氮气除氧 3min。立即将此混
6、合溶液注入处理过的毛细管中，并用硅橡胶将两端密封，放入 60oC 恒温水浴中连续加热 24h，通过热引发在柱管中原位聚合制得聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体柱（基质） 。反应完成后，将整体柱连接在液相色谱高压泵上，用乙醇和水冲洗毛细管除去致孔剂、未反应单体及其他可溶性物质。 2.4 整体柱的阳离子交换修饰利用亚氨基乙二酸对聚甲基丙烯酸缩水甘油酯整体基质进行离子交换改性，在固定相上键合羧酸基，从而获得弱阳离子交换整体固定相。将 5g 亚氨基乙二酸和 2g NaCl 加入 50mL 2mol/L 碳酸钠溶液中，用 NaOH 调节 pH 至 12.0，用泵将该溶液以 10 L/min 流速循环流过 1.3
7、 节制备好的整体柱基质，75反应 24h。反应完成后，用 10 倍体积水冲洗，再用 0.1mol/L NaOH 溶液以 0.05ml/min 流速冲洗整体柱。中国色谱网 3 结果与讨论 3.1 温度对聚合物孔结构的影响将相同配比的反应混合物分别在 50 、60 和 70 条件下反应 24h，然后用压汞法测定所得聚合物的孔径分布和比表面积，图 1 是不同温度下合成的整体材料的孔径分布图。实验结果显示：随着聚合温度的升高，整体材料的孔径变小。50oC 时孔径主要分布在8001200nm；60 时主要分布在 100 300nm ；70 孔径小于 50nm。 根据原位聚合反应机理，温度主要影响聚合反应
8、过程中引发剂的分解速度。反应温度越高，单位时间内引发剂形成的自由基数目越多，形成核的数目也越多。核数目的增加使得每个核的尺寸减小，从而形成小的颗粒。而大孔材料是由相互交联的颗粒组成的，所以小颗粒之间的空隙也小。另外，高温下形成的小孔聚合物质地紧密，能够承受较高的压力。综合考虑整体柱基质的渗透性和机械强度，本实验选择聚合温度为 60。 图 1 在 70(1)、60(2) 和 50(3) 下甲基丙烯酸缩水甘油酯整体材料的孔径分布图 3.2 致孔剂组成对聚合物孔结构的影响形成大孔结构的必要条件是交联的核与反应溶液间发生相分离。影响聚合物在反应溶液中溶解性质的重要因素是致孔剂的种类、组成和总含量。正丙
9、醇、1,4-丁二醇和水组成的三元致孔剂体系不需要使用其它辅助溶剂就可以得到均一的混合溶液，能够在很宽的范围内控制整体柱孔径分布。 整体材料的孔隙率可以通过调节单体与致孔剂的比例来控制。表 1 所列 4 根整体柱是不同单体和致孔剂配比。柱 A、B、C 和 D 均为 5cm 长，流速为 10L/min，甲醇作流动相。实验结果是：流动相不能从柱 A 流出，柱 B、C 和 D 的柱压分别为 49bar、144bar和 27bar。即致孔剂比例高的 B 和 D 柱的渗透性明显好于致孔剂比例低的 A 和 C 柱。 多元致孔剂的组成比对整体柱渗透性也有明显影响。固定 GMA 与 EDMA 的比例，同时也固定
10、致孔剂中水含量。实验发现致孔剂中正丙醇含量减小，整体柱孔径明显增大。 表 1 反应混合物的配比GMA：甲基丙烯酸缩水甘油酯；EDMA：乙二醇二甲基丙烯酸酯 3.3 交联剂含量对聚合物孔结构的影响固定致孔剂组成不变,GMA 和 EDMA 的比例分别为 3/1、4/1 和 7/1。实验结果显示，随着交联剂 EDMA 含量的减少，整体固定相平均孔径从 2451nm 增加到 5189nm。综合考虑整体柱的渗透性和机械强度，本实验选择 GMA/EDMA=4/1。综合以上考察，最终选择制备聚甲基丙烯酸缩水甘油酯基质的最佳试剂配比为：GMA：EDMA：正丙醇：1,4-丁二醇：水=0.32 ：0.08：0.3
11、5：0.2 ：0.05。 3.4 整体固定相表面改性条件优化离子交换功能层的主要性能参数是交换容量。影响交换容量的主要因素包括改性时间、温度和 pH 值。本实验对上述三个条件进行了优化。测定交换容量时的柱尺寸均为 50 0.32mm ID，柱容积为 4 L，流速为 0.1mL/min，模型蛋白质溶菌酶的浓度为1mg/mL。 当固定改性剂 pH12.0 和反应时间 24h，反应温度分别为 40、60和 75时，测得的交换容量依次为 1.53、10.5 和 21.5mg/mL。即反应温度越高，得到的整体柱的交换容量越大，本实验选择反应温度为 75。 当固定改性剂 pH12.0 和反应温度 75，改
12、性时间分别为 8h、16h、24h 和 32h 时，随着改性时间的增加，交换容量迅速增加，改性时间达到 24h 后,交换容量不再增加。因此，本实验选择改性反应时间为 24h。 当固定反应温度 75和反应时间 24h，改性剂 pH 值分别为 11.0、12.0 和 13.0 时，随着 pH 增加，交换容量明显增加。但过高的 pH 值会破坏整体固定相与毛细管内壁之间的结合。当 pH 值达到 13.0 时，固定相很容易被冲出。综合考虑，本实验选择 pH12.0。 3.5 弱阳离子交换整体柱分离蛋白质图 2 是三种模型蛋白质（粗卵蛋白、胰蛋白酶和溶菌酶）在本实验所制备的一根 5cm长的弱阳离子交换毛细
13、管整体柱上的色谱图。流动相 A 为 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（pH6.0）, 流动相 B 为流动相 A 中含 1.0mol/L 醋酸钠（pH6.0 ） 。梯度洗脱程序为： 0-2min，0% B； 2-2.1min,0-5% B；2.1-3.1min，5% B；3.1-3.2min，5-20% B；3.2-4.2min ，20% B。进样体积 1 L 。紫外检测波长 280 nm。3 种蛋白质在 13min 内完全分离，表明该柱可以用于蛋白质的分离分析。 电压,voltage（V）图 2 蛋白质（依次为粗卵蛋白、胰蛋白酶和溶菌酶）在弱阳离子交换毛细管整体柱上的分离4 结论：本研究以甲基
14、丙烯酸缩水甘油酯为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，原位聚合制备了大孔型甲基丙烯酸酯整体基质，再利用亚胺乙二酸进行一步改性，获得了具有羧酸基团的弱阳离子交换毛细管整体柱，该柱可用于蛋白质的分离分析。 参考文献：1 鲍笑岭，许旭. 分析化学，2005，33（11）：16531658 2 马继平，丁明玉. 分析化学， 2006，34（9）：S272S277 3 Svec F, Frechet J M J. Anal.Chem.，1992，64：820822 4 Palm A, Novotny M V. Anal.Chem., 1997，69：44994507 5 Gusev I, Huang X
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