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1、 血红蛋白的提取和分离（二）主讲：黄冈中学优秀生物教师王小敏回顾上节课：二、实验操作阅读血液组成成分，思考：1、血液由血浆和血细胞两部分组成。2、血细胞中红细胞细胞数量最多，红细胞的含量最高的有机化合物是血红蛋白。3、该化合物是由2条-肽链和2条-肽链构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的亚铁血红素基团。（一）样品处理本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。思考1：你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？ 哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。1、红细胞的洗涤：洗涤目的：是去除杂蛋白。以利于后续血红蛋白的分离纯化。洗
2、涤方法：思考2：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。2、血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟。思考3：加入的蒸馏水、甲苯的作用分别是什么？充分搅拌的目的是什么？蒸馏水的作用：使红细胞大量吸水胀裂。甲苯的作用：溶解红细胞的细胞膜。充分搅拌的目的：加速红细胞的破裂。3、分离血红蛋白溶液：（二）粗分离透析1、过程：将血红蛋白溶液装入透析袋，置于磷酸缓冲液（pH为7.0）中，透析12小时。在透析过程中，血红蛋白不能通过半透膜，而离子和小分子能够通过半透膜扩散进
3、入磷酸缓冲液中。2、透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。（三）纯化凝胶色谱操作1、凝胶色谱柱的制作：取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：橡皮塞打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。2、凝胶色谱柱的装填装填材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）、20mmol/L磷酸缓冲液“G”：表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75：表
4、示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。步骤操作要求固定色谱柱色谱柱垂直固定在支架上计算称量凝胶根据色谱柱体积计算凝胶用量配制悬浮液凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀或：凝胶颗粒洗脱液沸水浴装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h注意事项：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不得有气泡存在。因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。洗涤时，液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。3、样品加入与洗脱调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液
5、缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：小心加入pH7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）注意事项：正确的加样操作：不要触及并破坏凝胶面。贴壁加样。使吸管管口沿管壁环绕移动。（四）纯度鉴定聚
6、丙烯酰胺凝胶电泳鉴定（略）三、操作提示1、红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2、色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。3、凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡4、色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。四、结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？观察你处理的血液样品离心后是否分层，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱
7、装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效
8、果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。课堂小结：- 返回 - 同步测试一、选择题1、凝胶色谱法分离蛋白质的依据是（）A对其他分子的亲和力B溶解度C所带电荷多少D相对分子质量的大小2、凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（）A糖类化合物B脂质C蛋白质D核酸3、选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料，有何好处（）A血红蛋白是有色蛋白B红细胞无细胞核C红细胞蛋白质含量高D红细胞DNA含量高4、将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（）A甲苯B血红蛋白水溶液C脂溶性物质的沉淀层D其他杂质的沉淀5、血红蛋白因含有（）而呈红色。AO2BCOCCO2 D血红素6、下列操作正确的是（）A分离红细胞时采用低
9、速长时间离心B红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可C分离血红蛋白溶液是低速短时间离心D透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h7、样品的加入和洗脱的叙述正确的是（）A先加入1ml透析后的样品B加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出C如果红色带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功D洗脱时可以用缓冲液也可以用清水8、下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（）A样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液B通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取C可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化D可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度9、凝胶色谱
10、法操作正确的是（）A将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴B将橡皮塞下部切出凹穴C插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面D将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片10、样品的加入和洗脱的操作不正确的是（）A加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面DAADD DCBAD二、非选择题11、电泳利用了待分离样品中各种分子_以及_、_的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。显示答案11、带电性质的差异
11、；分子本身的大小；形状的不同12、下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入（图）和洗脱（图）示意图，请据图回答下列问题。（1）在加样示意图中，正确的加样顺序是_。（2）用吸管加样时，应注意正确操作，分别是_（3）等样品_时，才加入缓冲液。（4）待_接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每_mL收集一管，连续收集。显示答案12、（1）（2）不要触及破坏凝胶面贴着管壁加样使吸管管口沿管壁环绕移动（3）完全进入凝胶层（4）红色的蛋白质513、血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2、CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。（1）将实验流程补充完整：A为_，B为_。
12、凝胶色谱法的基本原理是根据_来分离不同种类的蛋白质。（2）洗涤红细胞的目的是去除_。洗涤干净的标志是_。释放血红蛋白的过程中起作用的是_。（3）透析的作用是_。显示答案13、（1）血红蛋白的释放样品的加入和洗脱相对分子质量的大小（2）去除杂蛋白，利于后续步骤的纯化上清液中没有黄色蒸馏水和甲苯（3）去除小分子杂质-END- 课外拓展电泳（1）根据说明书安装电泳用的玻璃板。（2）配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液。用去离子水4.6mL，30%的丙烯酰胺2.7mL，1.5mol、pH 8.8的Tris缓冲液2.5mL，10%的SDS 0.1mL，10%的过硫酸胺0.1mL，TEMED 0.006
13、mL，混合均匀，迅速灌注在两玻璃板的间隙中间，要留出灌注浓缩胶所需空间（梳子的齿长再加0.5cm），再在胶液面上小心注入一层水（约高23mm），以阻止氧气进入凝胶溶液。（3）分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。（4）配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶溶液。用去离子水2.7mL，30%的丙烯酰胺0.67mL，1.0mol、pH 6.8的Tris缓冲液0.5mL，10%的SDS 0.041mL，10%的过硫酸胺0.04mL，TEMED 0.004mL，混合均匀，直接灌注在聚合的分离胶上，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。整个操作过程应注意避免气泡的产生。然后再补加浓缩胶溶液，使其充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下聚合。（5）在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理。在电泳样品中按11体积比加入样品处理液，在100 温度下加热3 min，以使蛋白质变性。（6）浓缩胶聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液。必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。（7）按顺序加样，加样量通常为1025L。样品可以多加几个，例如，血浆样品红细
