遗传学实验

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1、遗传H E R E D I T A S ( B e i j i n g ) 4 ( 3 ) : 3 6 -3 8 1 9 8 2 遗传学实验 （ 复 旦 大 学 生 物 系 ） 实验原理 在 D N 人复制过程中，5 - 澳脱氧尿咯吮核 昔 ( 5 - B r o m o d e o x y - U r i d i n e 简称 B r d U r d ） 掺入 新合成的 D N A 链， 并占有胸腺咯咤 ( T h y m i d i n e , T ）的位置， 所以哺 乳类细胞 在含有 B r d U r d的 培养液中 经历两个分裂周 期的培养之后， 其两条姊妹染色单体的D N A双链在

2、化 学组成上就有了差别：即一条染色单体的 D N A 双链 之一含有 B r d U r d ，而另一染色单体的 D N A双链都含 有B r d U r d ，这样的细胞经 过制片 和荧光素染色后， 就 能观察到两条明暗不同的染色单体。二股都有 B r d U r d 的姊妹染色单体发出的荧光较强，其 中只有一 股有 B r d U r d的 单体荧光 较弱。利用这 种方法， 可以清 楚地 看到姊妹 染色单 体交换的情况（ 图1 8 - 1 ) 0 近年来，有一些实验室不用荧光 染料，而改用 G i e m s ：染色， 也得到满意 结果。 由于计算姊妹染色单体互换比观察染色体畸变更 客观、

3、 方便， 对许多诱变剂、 致癌剂的作用又非常敏感， 表现出很好的剂量效应关系， 因此， 目前已把此法列为 检测致癌物的常规指标之一。 实脸准备 1 用具：与血培养实验相同。 2 药品配制： ( 1 ) R P M I 1 6 4 0 培养液：见血 培养实验试剂配制 一 节。 ( 2 ）小牛血清：最好经过透析处理。将小牛血清 装入透析袋中，用线扎紧封口，小心检查，切勿有漏 孔。 然后将 透析袋 放在盛有双重蒸 馏水的 玻璃器皿 中， 每隔 1 -2 小时换一次水， 搁置在 4 冰箱中， 2 4 小 时后用赛氏滤器灭菌过滤。 ( 3 ) P H A溶液：见血培养实验试剂配制一节。 ( 4 ) 3

4、. 5 % N a H C O ， 溶液： 称 3 . 5 克 N a H C 0 , 用 1 0 0 毫升双蒸水溶解，1 0 磅 1 5 分钟高压灭菌，作 调节p H用。 ( 5 ) B r d U r d溶液：用无菌青霉素瓶， 在普通条件 下用电光分析天平称取 B r d U r d 2 毫克， 然后在无菌室 内加入无 菌生趣盐水斗 毫升， 母液 的浓度为0 . 5 毫克 细胞培养在 B r d Ur d 中生长一个周期， 染色体复制一次 加B r d U r d 后纽 胞第一次分裂 中期的染色体 细胞培养在B r d U r d 连续生长两个周期 染色体复制两次 细胞培养在B r d U

5、 r d 中 连续 生 长 三 个 周期 染色体复制三次 加B r d U r d后细 胞第二次分裂 中期的染色体 加MUM后细 胞第三次分裂 中期的染色体 图1 8 - 1 在 B r d U r d中连续生长三个周期的细胞及其染色体 毫升。用黑布避光， 置冰箱中保存。最好现配现用。 ( 6 ) 1 M N a H 2 P O 4 9 p H8 . 0的溶液： 称取 1 2 0 克 N a H , P O , ，加人 1 0 0 0 毫升双蒸水，用 N a O H 粉宋调 L(1 Qu n : A n Ex p e r i me n t i n Ge n e t i c s （ 十八） 姊妹

6、染色单体色差方法 3 6 P H至 8 . 0 即可。 ( 7 ) 2 x s S C溶 液( o 3 M抓化钠， 0 . 0 3 M拘椽 酸 钠） ：称取 N a C I 1 7 5 4 克， 拘椽酸钠 8 . 8 2 克， 各用蒸 馏水 1 0 0 0 毫升溶解， 使用时两溶液等 量相混合。 ( 8 ) P H为 ， 9 8 的M 八， 磷 酸缓冲液： 甲液：取 K H , P O , 9 . 0 8克， 溶于 1 0 0 0 毫升蒸馏 水中。 乙液： 取N a ,H P O , 2 H , 0 1 1 . 8 8 克或N a ,H P 0 , 1 2 H , 0 2 3 . 8 7 克，

7、 溶于1 0 0 0 庵升 燕馏水中。将4 4 . 8 毫升的甲液与 5 5 . 2 毫升的乙液混合， 即得p H为 6 . 9 8 的 M 1 1 5 磷酸缓冲液。 实验步软以人的外周血为材料。 1 在无菌条件下，用 2 0 毫升的青霉素瓶分装 5 毫升培养 液， 其中 R P M I 1 6 4 0 8 0 ； 小牛血 清 1 5 - 2 0 %; P H A 0 . 2 毫升； 青雄 素1 0 0 单 位 毫升： 链霉素 1 0 0 微克 毫升。 最后用 3 . 5 9 1o N 2 H C O ; 调节 p H 至 7 2 -7 . 4 0 2 .甸 ， 毫升的培养液中加人 B r d

8、 U r d 0 . 1 毫 升， 最终浓度为 1 0 微克 毫升。 3 每瓶培 养液中加入03 毫升静 脉血， 轻轻摇 匀， 用黑布避光， 立即置3 7 0C温箱中培养。 4 .培养 7 2 小时左右， 加人秋水仙素 0 . 4 -0 . 8 微 克 毫升， 继续培养 4 小时。 5 按常规收集细胞， 用 0 . 0 2 5 M K C I 或蒸馏水低 渗 2 0 分钟，用甲醇、 冰醋酸 3 : 1 配制的固定液固定两 次， 每次 巧分钟， 用气干法制片， 一夭以后将染色体制 片， 放入 7 0 -8 0 烤箱中洪烤1 -2 小时， 或放在 3 7 9 0 温箱中存放备用。 后处理方法 有两

9、种： ( 1 )碱的热溶液处理： 将染色体标本浸泡在 8 8 C 的 1 M N a H 2 p 0 , ( P H为 8 . 0 ） 的溶液中， 处理 2 0 分钟， 取出后立即用蒸馏水冲洗，用常规 G i c i n s a染 色 ， 分 钟， 再用蒸馏水冲洗， 千燥， 观察。 ( 2 )紫外灯照射诱发：染色休标本在 3 7 条件 下搁置 2 4 小时后取出， 在玻片上滴加 2 x S S C液， 然后 放在 4 5 -4 8 恒温水浴锅上用 1 5 W紫外灯照射3 0 分 钟， 灯管与载玻片之间距离为 6 厘米。照射完毕， 用旅 馏水冲去 2 x S S C , 常规 G i e m s

10、 a染色（ 用P H 6 . 9 8 磷酸 缓冲液稀释） 5 -1 0 分钟， 再用燕馏水冲洗， 千燥， 观 察。 夕 在普通光学显微镜下观察， 可见姊妹染色单体 呈现鲜明的深浅不同的颜色。 注愈事项 1 . B r d U r d的溶液最好现配 现用， 一次 使用 不完， 必须用黑布避光， 4 C冰箱中保存。 2 . B r d U r d在培养开始时加人， 或在培养后的 2 4 小时时加人均可。 3 用紫外灯照射诱发姊妹染色单体互换时， 如紫 外灯功率大、 W数高， 照射的时间就应相应地减少。 （ 吕群 ） （ 十九） 活体骨髓细胞姊妹染色单体色差方法 实验原理 近年来，由于姐妹染色单休差

11、别染色方法的发展 和应用， 为染 色休的分子结构 、D N N复制、损伤、 修 复和细胞周期等基本问题的研究提供了许多可贵的资 料。但这些研究大多采用组织培养的材料或外周血淋 巴细胞培养方法， 是在离休条件下进行的， 有一定的局 限性。活体骨髓细胞姊妹染色单体色差方法可直接地 反映各种化学致痛物、 诱变剂及各种射线的诱变作用， 因此这是一个较为灵敏和可靠的检测环境污染因子 的 方法。 活休中姊妹染色单休色差方法的原理和机制与离 体方法基本 L 是相同的，但要在细胞复制的两个周期 中，不断地补充外源的核普酸类似物 5 - 澳 脱氧尿昔 ( 1; r d U r d ) 或5 一 碘脱 氧尿昔 (

12、 1 d U r d ) 。在 D N A复制 过 程中，B r d U r d或 1 d U r d替代了胸腺啥喧使两条姊妹 染色单 体的 D N A双链在化学组成上有了差别，经过 染色， 显示出色差。 但是应用哺乳动物骨髓细胞姊妹染色单体色差法 时， 难以得 到足 够数里的中 期分裂相和清 晰的姊 妹染 色单体互换图象，采用酵母浸出液刺激动物骨髓细胞 之后， 可大大增加有丝分裂中期相的数目。 实验准备 图 1 9 1 d Ur d药片的制备 3 夕 1 工具：手术用剪刀 （ 1 6 , 1 2 厘米） ， 镊子（( 1 0 - 1 2 厘米） ， 止血钳( 8 -1 2 厘米） ， 手术用

13、针 和外科 手术 用丝线， 压制药片的压 片机一付 （ 孔的内径为。 . 5 厘 米） ， 纱布， 酒精和碘酒棉球。 2 . 器皿：烧 杯（ 1 5 , 5 0 毫升） ， 离心管， 吸管， 载玻 片， 针简（ 1 毫升） ， 量筒 ( 5 0 , 1 0 0 毫升） 。 3 ， 药品配 制： ( 1 ) 1 0 %醉母制荆：称取 千酵母粉（ 上海 酵母厂） 2 . 5 克、 葡萄塘5 . ， 克， 加人2 5 毫升 4 0 的温水， 充 分混匀， 置 4 0 0 9C温箱中保温 1 . 5 -2 小时， 待液休表面 有少量气泡出现即可使用。 ( 2 ）秋水仙素：称 ， 毫克的药粉，用 ， 毫

14、升生理 盐水溶解。使用时按 4 毫克 公斤量注射。 （ 劝 0 . 8 5 % 生理盐水：称 0 . 8 5克的抓化钠，用 1 0 0 0 毫升 双蒸水溶解。 （ 勺 0 . 5 %氮化钾：称 。 . 5 克的氯化钾， 用 1 0 0 毫 升双蒸水溶解。 ( 5 ) G i e m s a染液：参照血培养试剂配制一节。 （ ） 。 1 M磷 酸缓冲液：参照血培 养试剂配制一 节。 ( 7 ) 2 x S S C溶液： 参照姊妹染色单体色 差方法 药品配制一节。 实验材料 ，合 一 ， 月 育 龄 的 纯 系 刁 、 鼠 ， 体 重 为 8 克 左 右 。 实验方法 1 . 5 - 碘脱氧尿普(

15、 I d U r d ） 药片的制备：按 7 5 0 毫 克 公斤的盆， 称取 I d U r d 1 5 -2 0 毫克， 棉白塘作为填 充料 （ 粘合荆） ，其用量与 I d U r d是 1 : 1 ， 两者均匀混 合， 放入内径为 。 ， 厘米的凹形模子内， 插上内心， 外 加 一压力， 使 药粉成片剂， 然后 取出内 心， 轻轻将药片 取出 （ 图 1 9 ) 0 2 . I d U r d药片 的埋植：将小鼠腹 部向上， 在腹中 线大腿内侧下凹处用剪刀局部去毛， 经碘酒、 酒精消毒 后， 用手术小剪子开一小口（ 约0 . 5 厘米长） ， 迅速将药 片用小镊子埋入伤口的皮下， 然后

16、用手术针缝合伤口， 一般缝一针， 如伤口 较大可以缝两针。 3 . 1 0 % 酵母制剂的注射：用 1 毫升的注射针筒， 吸人1 0 的酵母浸出 液0 . 3 -0 . 4 毫升， 在小鼠背 部 皮下注人， 然后将实 验鼠 放回 笼内 。2 6 小时后， 腹腔 注人 秋水仙 素（ 每 公斤 动物体 重注射4 毫克） 。再经2 小时杀死动 物， 剥 离大 腿骨， 用纱 布将腿骨 外的 肌肉 剔 除干净， 浸人盛有生理盐水的烧杯中。 4 骨髓细胞的制备：用骨钳将大腿骨充分压碎， 用生理盐水洗出骨髓细胞，自然沉降后吸出细胞悬浮 液， 弃骨头碎片， 1 0 0 0 转 分离心7 分钟， 弃上清液， 留 下骨髓细胞。 5 细 胞学技 术： ( 1 )用0 . 5 % K C 1 低 渗液7 毫升加入 盛有骨髓细 胞的 离心管中， 用吸管缓 慢冲打均匀， 放入3 7 9C 温箱 低渗2 0 分钟， 然后取出 离心管， 以每分 钟 1 0 0 。 转离心 7 分钟。 ( 2 ）用甲 醇、 冰