植物组织培养实验室的构建

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1、,第二章,植物组织培养实验室构建,（图为潍坊职业学院生物技术专业组培中心）,植物组织培养是以无菌操作为基础的，它需要在一定的实验条件和特定的实验环境下完成一系列操作，以无菌条件为重要前提，模拟植物细胞生长发育需要的各种设备、设施、培养条件，是从事本领域工作的基础。,一、植物组织培养实验室设计 二、仪器和设备 三、玻璃器皿和用具,主要内容,1、实验室要求 环境要求：理想的植物组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。规模化生产的实验室最好建在交通方便的地方，便于产品的运送。 实验室的建设均需考虑两个方面的问题：一是所从事的实验的性质，即是生产

2、性的还是研究性的，是基本层次的还是较高层次的；二是实验室的规模，规模主要取决于经费和实验性质。,一、实验室设计,实验室设置的基本原则是：科学、高效、经济和实用。一个植物组织培养实验室必须满足3个基本的需要：实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌）、无菌操作和控制培养。此外，还可根据所从事的实验要求来考虑辅助实验室及其各种附加设施，使实验室更加完善。,2、标准组织培养室组成,准 备 室,洗涤室,接种室,培养室,灭菌室,组培实验室,驯化室,植物组织培养实验室 的组成,分体式-研究性质实验室，分开的若干房间将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌室等，功能明确，便于管理，但不

3、适于大规模生产。 通间式-规模化实验室，一般设计成大的通间，试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。便于程序化操作与管理，减少各环节间的衔接时间，提高工作效率。还便于培养基配制、分装和灭菌的自动化操作程序设计，减少规模化生产的人工劳动，更便于无菌条件的控制和标准化操作体系的建立。,案例1：实验室平面设计,案例2：实验室构成,1、准备室 功能：又叫化学实验室，进行一切与实验有关的准备工作：器皿洗涤、完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养材料的预处理等。 要求：最好有20平方米左右。要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验

4、室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。 设备：准备室应具备工作台、天平，柜橱、水池、仪器、蒸馏水器，磁力搅拌器，冰箱等。,药品柜,冰箱,天 平,磁力搅拌器,恒温水浴锅,2、洗涤室（区）,功能：完成各种器具的洗涤、干燥、保存、材料预处理，同时兼顾试管苗出瓶等。 要求：需安装一个较大的水池，水泥制作，白瓷砖砌内外表面，池底放一张橡胶垫，以减少玻璃器皿的破损。下水道应畅通，以免妨碍工作。 设备：玻璃器皿、塑料器皿、周转箱、洗涤刷、洗瓶机、洗涤剂、晾干台等。,要求：20 m2左右，明亮，通风。配置大型工作台1张。 功能：培养基配制、分装、 高压灭菌，无菌水的制备以及其它物品的高压灭菌等。 设备：高压灭菌

5、器、电炉、不锈钢锅、培养基分注器、物品橱1-3个，用以放置线绳、封口材料等。此外还应有烘箱、天平、酸度计、盆与桶等。,3、培养基制作与灭菌室（区）,要求：接种室要求干爽安静，清洁明亮。接种室宜小不宜大，一般1020平米，要求地面、天花板及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒，地面及内墙壁都应采用防水和耐腐蚀材料，室内物品越少越好。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动；室外设有缓冲间。 功能：主要用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、试管苗的继代以及一切需要进行无菌操作的技术程序。 主要设备：紫外光源、超净工作台、消毒器、酒精灯、接种器械（接种镊子、剪刀、解剖刀、接种针）、紫外线灭菌灯、空调等。

6、,4、无菌操作室（接种室）,缓冲间 功能：是进入无菌室前的一个缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。工作人员在此换上工作服、拖鞋，戴上口罩，才能进入无菌室和培养室。 要求：可建在准备室外（需3-5平方米）或无菌操作室外（面积1平方米为宜），应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩，并有清洁的实验用拖鞋、已灭菌过的工作服；墙顶用1-2盏紫外灯定时照射，对衣物进行灭菌。 设备：1-2盏紫外灯、灭菌后的工作服、拖鞋、口罩。,5、培养室（区） 功能：对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，无论是研究性实验室还是生产性实验材料进行培养的场所。 要求：约需10-20平方米左右。基本要求是

7、能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境，因此，培养室应保持清洁和适度干燥；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装排风窗和换气扇等培养室的换气装置；为节省能源和空间，应配置适宜的培养架，并安装日光灯照明。 主要设备：培养架（控温控光控湿）、温湿度计、摇床、培养箱、光源、除湿机、换气扇、紫外光源等。,6.观察室,功能：观察并研究培养材料的生长分化情况及其形态发生规律；检查培养材料是否脱毒和发生变异。 主要配备：生物显微镜，切片机，酶联免疫检测仪，PCR扩增仪等。,要求：室内清洁、明亮、安静，设备先进。,7. 驯化棚室,要求：能够控温调湿、控光通风。 面积：据规模来定。 注：室内驯化与设施下

8、驯化均可。,功能：提供组培苗炼苗的环境。,作业： 植物组织培养基本实验室包括哪些组成?各有何功能与要求？,二、仪器和设备,、烘箱 陈列于洗涤室 作用：干燥洗后的器皿 高温干热灭菌 测定培养物的干重 气浴,、冰箱,各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温保存，某些试验还需植物材料进行低温处理，普通冰箱即可。 陈列于 中,4、加热器 用于培养基的配制。研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器，规模化大型实验室用大功率加热和电动搅拌系统。 5、其它 纯水器、分装设备,6、超净工作台,其操作台面是半开放区，具方便、操作舒适优点，通过过滤的空气连续不断吹出，大于0.03um直径的微生物很难在工作台

9、的操作空间停留，保持了较好的无菌环境。由于过滤器吸附微生物，使用一段时间后过滤网易堵塞，因此应定期更换。 陈列于 中 类型：垂直式和水平式 作用：无菌操作用,7、酸度计,用于测定培养基及其它溶液的pH，一般要求可测定pH范围1-14之间，精度0.01即可。 陈列于 中,PHS-802中文台式酸度计,通用型或经济型酸度计,8、显微镜,陈列于观察室中 类型： 倒置显微镜 原生质体观察 普通显微镜 染色体和叶片气孔观察 荧光显微镜 细胞活力观察 解剖显微镜 立体观察,9、天平,植物组织培养实验室需要不同精度的天平。 感量0.001g的天平（分析天平）和感量0.0001g的天平（电子天平）用于称量微量

10、元素和一些较高精确度的实验用品。 感量0.01g和0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。 陈列于 中,10、高压灭菌锅 用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌，根据规模大小有手提式、立式、卧式等不同规格。,11、干热消毒柜 用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的灭菌。一般选用200左右的普通或远红外消毒柜。,13、紫外灯 方便经济的控制无菌环境的装置，缓冲间、接种室和培养室必备。,12、过滤灭菌器 用于一些酶制剂、激素以及某些维生素等不能高压灭菌试剂的灭菌，主要有真空抽滤式和注射器式。,14、培养架 目前植物植物组织培养实验室植株繁殖培养的通用设施

11、。成本低、设计灵活、充分利用培养空间。一般有4-5层，层间间隔30-40cm，长1.01.3米，宽0.6米，光照强度可根据培养植物特性来确定，一般每架上配备2-4盏日光灯。,15、培养箱 细胞培养、原生质体培养等要求精确培养的实验，可用光照培养箱、CO2培养箱、湿度控制培养箱等培养。 16、摇床 进行液体培养时，为改善通气状况，可用振荡培养箱或摇床。 17、生物反应器 进行植物细胞生产次生产物的实验室，还需生物反应器。,其他设备 可安装时间程序控制器、温度控制系统或空调；实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、录像和图像处理设备；电泳仪、萃取和层析设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相色

12、谱仪、酶联免疫测定系统。,1、培养容器 包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。一般分为： 玻璃容器一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质。 1.耐腐蚀；耐高温、高压； 2.透明度好； 3.便于接种。 塑料容器材质轻、不易破碎、制作方便，广泛使用。一般为聚丙烯、聚碳酸酯材料的培养容器。,三、玻璃器皿和用具,三角瓶：50、100、250、500ml或用250ml罐头瓶代替。 培养皿：6、9、12cm 试管：18180mm或20200mm 量筒：10、50、100、500、1000ml 烧杯：50、100、200、500、1000ml 容量瓶：100、200、500、1000ml 试剂瓶

13、（棕色）：50、100、250、500、1000ml 移液管：0.2、0.5、1.0、2、5、10ml,玻璃器皿的规格：,刻度移液管 在配制培养基时，生长调节物质和微量元素等溶液，用量很少，只有用相应刻度的移液管才能准确量取。同时，不同种类的生长调节物质，不能混淆，这就要求专管专用。常用的移液管容量有0.1ml、0.2ml、0.5ml、2ml 、5ml、10ml等。,1）镊子类：接种、转移材料或分离茎尖用，以100ml三角瓶为培养瓶，可用20cm长。,2、金属用具,2）剪刀类：医用剪刀，剪切割外植体或继代培养时分离材料。,3）解剖刀：切割芽、茎段、愈伤组织等，继代时分离材料，也可用于微小外植体

14、的接种等。,4）解剖针：转移细胞或愈伤组织，微茎尖分离及接种等。,5）其它：周转筐 搪瓷盘 移液管架 、玻璃棒、酒精灯、试管架等。,3、塑料用具 各种封口膜、盖、塑料盘及其它实验用具。,思考题 1、植物组织培养实验室包括哪些部分？ 2、植物组织培养实验室的常规设备有哪些？ 3、简述无菌操作设备的类型及作用？,一、内容 1新器皿洗涤 新玻璃器皿，无论是软玻璃或硬玻璃，都有游离的碱性物质，会影响组培试验结果，使用前必须洗涤。 2使用过的一般器皿如试管、烧杯、三角瓶等的洗涤。洗好后的瓶子应透明锃亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。 3使用过的量器如移液管、容量瓶、滴管及载玻片、盖玻片等的洗涤 二、材料准备 各种培养瓶、移液管、洗衣粉、洗液、周转箱、瓶刷、洗涤池、蒸馏水等。,实践二 洗涤技术,三、方法与措施 1.新玻璃器皿先用1%的Hcl溶液浸泡一昼夜，然后再按一般使用过的玻璃器皿进行洗涤。 2.使用过的培养器皿洗涤方法是先将器皿中的残渣废液除去，用清水冲洗净。再用浓洗衣粉水浸泡1530min，然后用瓶刷沿瓶壁上下刷动和呈圆周旋转两个方向刷洗，瓶外也要刷到，不要留下未刷到之处，最后用流水冲洗34次，以彻底冲去洗衣粉残留物。 3 .用过的移液管、载玻片、盖玻片先放到铬酸洗液中浸泡2h以上，取出后经流水冲洗0.5h左右，再用蒸馏水冲洗一次，放入干燥箱内烘干或晾干。 四、作业 实验报告一份,