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1、广州中医药大学 博士学位论文 调肝方药对皮质酮、谷氨酸致PC12细胞损伤模型的保护效应及 机制研究 姓名：宋清 申请学位级别：博士 专业：中医基础理论 指导教师：徐志伟 20070401 中文摘要 应激( s t r e s s ) 指机体在受到各种内外环境因素刺激时所出现的非特异性全身反 应，心理应激是机体通过认识、评价而察觉到应激原的威胁时引起的心理、生理机能 改变的过程。随着社会发展和竞争压力的增加，心理应激已成为一个威胁人类健康不 可忽视的重要因素。慢性心理应激在心脑血管病、内分泌疾病、神经精神疾病和自身 免疫性疾病的发生中起重要作用，使机体出现正常衰老过程加速、学习记忆障碍、应 激性
2、精神紊乱、痴呆、抑郁症、免疫力低下等多系统疾患，其中抑郁症是临床最常见 的身心疾患之一。本病属于中医“郁证”范畴，其病机的核心是由于肝郁而造成郁证。 肝为刚脏，五行归木，“体阴而用阳”，喜条达，恶抑郁，主疏泄。肝主疏泄通过调 节气机、血和津液而调畅情志。情志变化过激，出现肝失疏泄、气机逆乱，造成一系 列心身反应疾病，所以心理应激反应成为研究肝主疏泄调畅情志功能的神经生物学机 制的切入点，而应用中医学肝主疏泄理论进一步探讨抑郁症的病因学机制和抗抑郁治 疗药物的研究具有十分重要的意义。 中医藏象及七情学说认为不良环境或精神刺激与疾病的发生发展密切相关，病理 性的心理应激反应即属于中医学所述情志异常
3、的范畴，肝失疏泄所致生理病理改变的 发生发展在一定程度上也是一种病理性的心理应激反应，即肝主疏泄功能在调节心理 应激反应和抑郁症的防治中具有重要作用。本研究室长期以来从事肝主疏泄调畅情志 功能的中枢神经生物学机制研究和探讨，取得了重要的研究成果和进展。近年重要工 作是结合中医整体观和平衡观以及现代心理应激理论，以心理应激反应为切入点，提 出中医学肝主疏泄调畅情志的功能存在着一定具体的神经生物学机制，并用方、证、 效、脏腑功能本质的研究思路，通过建立慢性心理应激反应模型模拟肝失疏泄、情志 异常的综合病理变化过程，根据实际病理变化组方用药体现出疏肝，柔肝，平肝以及 清肝的综合调治的思想，通过调肝方
4、药加味四逆散在治疗上的药物效应来进一步反证 和揭示肝主疏泄，调畅情志功能的有关神经生物学机制 本研究立足于以往研究基础，结合目前国内外的相关研究，在细胞和分子水平进 步探讨调肝方药加味四逆散治疗效应的微观物质基础。实验选用具有神经元特性和 功能的P C I 2 细胞，利用皮质酮( t o r t ) 、谷氨酸( 6 1 u ) 作用于体外培养的P c l 2 细 胞作为研究模型，体外模拟抑郁症病人出现的高糖皮质激素( G c ) 水平及谷氨酸堆积 状态，运用中药血清药理学方法、流式细胞术、免疫荧光、免疫印迹等方法，针对慢 性心理应激可导致对神经细胞损伤这一关键问题，观察调肝治法方药加味四逆散含
5、药 血清的药物学效应，从微观方面阐明和揭示调肝治法方药抗慢性应激致神经细胞损伤 的机理，为今后研制开发抗抑郁症中药新药提供理论依据。本研究分为四部分： 第一部分加味四逆散含药血清对皮质酮、谷氨酸致P C I 2 细胞损伤的保护作用 抑郁症病人有不同程度的情绪紊乱以及神经精神系统的损伤，长期处于应激状态， H P A 轴功能持续亢进，机体处于高水平的糖皮质激素状态。抑郁症发生后兴奋性氨基 酸谷氨酸堆积，导致神经元变性，引起海马神经元的凋亡和死亡，甚至出现大脑功能 形态损害。本部分实验观察调肝方药加味四逆散( J W S N S ) 含药血清对皮质酮、谷氨 酸致P C I 2 细胞损伤的保护作用。
6、加味四逆散组方为柴胡5 9 、自芍1 5 9 、枳壳6 9 、枸杞 子1 5 9 、山栀5 9 、干地黄1 8 9 、石决明3 0 9 组成。实验选用S P F 级雄性W i s t a r 大鼠，将 动物随机分为对照组、J W S N S 低、中、高剂量组( 分别含生药剂量0 8 4 6 、1 6 9 、3 3 8 4 k g L ) 。腹主动脉取血，分离制备含药血清。用倒置显微镜对培养的P C I 2 细胞、皮 质酮、谷氨酸、J W S N S 含药血清作用P C I 2 细胞2 4 h 后的细胞进行形态观察，用形态学方 法证明P C I 2 细胞培养成功。采用i 0 0 、2 0 0 、
7、4 0 0 F m o l L C o r t 、1 0 、5 0 、1 0 0 m o l 几G l u 及5 、1 0 J W S N S 含药血清分别与P c l 2 细胞共同孵育2 4 h ，以盯T 法测定细胞存活率， 观察不同浓度皮质酮、谷氨酸及加味四逆散含药血清对P C I 2 细胞生长的影响，结果显 示1 0 0 m o l L 、2 0 0 m o l L 、4 0 0 鼻m o l L c o r t 组细胞存活率分别为7 2 3 1 、5 3 8 5 、 2 6 1 0 ，1 0 m o l L 、5 0 口m o l L 、1 0 0 m o l L 谷氨酸组细胞存活率分
8、别为6 7 6 9 、 4 3 3 2 、2 1 5 4 ，不同浓度皮质酮和谷氨酸对P C I 2 细胞的生长均具有抑制作用，随着 皮质酮和谷氨酸的浓度升高，细胞存活率明显降低，细胞损伤程度加重，与正常细胞 对照组相比均有显著性差异( 仄O 0 5 0 0 0 1 ) 。5 J W S N S 含药血清低、中、高剂量组 细胞存活率分别为8 6 7 6 、9 8 4 1 和9 4 1 1 ，1 9 J W S N S 含药血清低、中、高剂量组细 胞存活率分别为8 5 2 9 、9 7 0 6 和8 9 7 1 ，5 、1 0 正常血清组细胞存活率分别为 9 2 6 5 和8 8 2 4 ，与正常
9、细胞对照组细胞存活率相比均无差异( 矽O 0 5 ) 。表明加味 四逆散含药血清对正常P C I 2 细胞无毒副作用。 选取2 0 0 m o l L C o r t 、5 0 _ m o l L G l u 为损伤模型组，以M r T 法观察加味四逆散含 药血清对皮质酮、谷氨酸所致P C I 2 细胞损伤的保护作用，结果显示2 0 0 F m o l L c o r t 、 5 0 F m o l L G l u 组细胞存活率分别为5 1 6 7 和4 6 7 7 ，与正常细胞对照组相比显著降低 ( 仄0 0 5 0 0 0 1 ) ，表明皮质酮和谷氨酸损伤P c l 2 细胞模型建立。C
10、o r t + 5 J W S N S 含药 血清低、中，高剂量组细胞存活率分别为4 6 7 7 、5 2 6 2 ，4 8 3 8 ，G l u + 5 J w S N S 含药血清低、中、高剂量组细胞存活率分别为4 5 1 9 、4 8 2 6 、4 6 7 7 ，C o r t 、G 1 u + 5 正常血清组细胞存活率分别为4 5 1 6 、4 3 5 5 ，C o r t 、G l u + 1 0 正常血清组细胞存活 率分别为5 6 2 9 9 6 、5 0 2 3 ，C o r t 、G l u + 5 J W S N S 含药血清组及C o r t 、G 1 u + 5 、l o
11、 正 常血清组细胞存活率与模型组相比均无显著差异( 少O 0 5 ) ，表明5 J W S N S 含药血清 组及正常血清均无明显抗损伤作用。C o r t + 1 0 J W S N S 含药血清低、中、高剂量组细胞 存活率分别为7 2 5 8 、8 7 1 1 、7 5 8 1 ，G l u + l o J W S N S 含药血清低、中、高剂量组 细胞存活率分别为6 9 3 5 、8 2 2 5 、7 0 9 7 ，与皮质酹、谷氨酸模型组及正常血清组 相比，细胞存活率均明显升高，差异有显著性( 仄O 0 5 - 0 0 1 ) ，表明1 0 加味四逆散 血清对谷氨酸、皮质酮所致P c l
12、 2 细胞的损伤具有保护作用。 n 第二部分加味四逆散含药血清对皮质酮、谷氨酸诱导P C I 2 细胞凋亡的保护作用及对 B D N F 蛋白表达的影响 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 是多细胞有机体在一定的生理条件下，通过内源性D N A 内 切酶的激活，主动结束生命的过程。慢性应激可以通过多种方式和途径引起神经元细 胞凋亡而参与应激所致的脑损害。脑源性神经营养因子( B D N F ) 在中枢神经系统发育过 程中起重要作用，对多种神经元有促进生存、有助分化和再生、增进代谢、增强功能 表达及营养、支持、保护的作用。其表达水平下降可引起抑郁症的某些病理生理过程。 本实验用形
13、态法、A n n e x i nV P I 双标流式细胞术观察加味四逆散含药血清对皮质酮、 谷氨酸诱导P C I 2 细胞凋亡的影响。实验分为正常细胞对照组、2 0 0 u m o l L C o r t 、 5 0 m o l LG l u 损伤模型组、2 0 0 F m o l L C o r t 、5 0 m o l LG l u 损伤+ I O J W S N S 含药血 清组、2 0 0 m o l LC o r t 、5 0 s m o l LG l u 损伤+ 1 0 正常血清组。用吖啶橙( A o ) 和 H o e c h s t 3 3 3 4 2 ( H o ) 荧光染色
14、观察皮质酮、谷氨酸致P c l 2 细胞凋亡的形态学变化； 在荧光显微镜下可见A 0 染色后活细胞的细胞核里亮绿色，死亡细胞的细胞核呈暗绿 色，胞质整个呈暗绿色。H o e c h s t3 3 3 4 2 染色后细胞核呈蓝色，活细胞的蓝色荧光最 强，而早期凋亡细胞蓝色荧光较弱。以细胞萎缩、核固缩、染色质凝聚、凋亡小体形 成和荧光强度增强等作为凋亡细胞指征，与正常组细胞相比，皮质酮和谷氮酸组细胞 生长状态较差，多见核染色质浓缩密集，边缘化，形成深染团块呈新月状或戒指状， 位于核膜下，核破裂出芽形成凋亡小体等细胞凋亡的形态学表现及死亡细胞；含药血 清组细胞生长状态较好，少见凋亡和死亡细胞形态。
15、采用A n n e x i nV P I 双标流式细胞术检测P c l 2 细胞凋亡率，可见正常细胞组细胞 凋亡率为( 1 6 2 4 0 7 8 ) ，2 0 0 弘m o i L C o f t 、5 0 m o l l LG l u 损伤模型组细胞凋亡 率分别为( 4 5 9 1 0 9 5 ) ，( 3 9 5 8 0 7 ) ，与正常细胞对照组相比明显升高 ( 仄0 0 0 1 ) ，表明皮质酮、谷氨酸可以诱导P C I 2 细胞发生早期凋亡。2 0 0 掣m o l L C o r t 、 5 0 m 0 1 LG l u 损伤+ I O J W S N S 含药血清组细胞凋亡率均
16、下降，其中中剂量组细胞凋亡 率分别为( 2 8 9 9 1 2 0 ) 、( 2 3 8 9 0 3 5 ) ，高剂量组细胞凋亡率分别为 ( 3 1 8 2 2 0 4 ) 、( 2 9 8 4 0 9 7 ) ，与2 0 0 z m o l L C o r t 、5 0 掣m o l LG l u 损伤模 型组比较差异有显著性( p ( O 0 5 - 0 0 1 ) ，2 0 0 F m o l L C o r t 、5 0 掣m o ：I LG 1 u 损伤 + I O 蜘S N S 含药血清组中、高剂量组细胞凋亡率明显低于2 0 0 _ m o l L C o r t 、5 0 _ m o l L G l u 损伤+ l0 9 6 正常血清
