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1、南方医科大学 硕士学位论文 aGVHD在allo-HSCT后小鼠弥漫性肺损伤的作用及机理研究 姓名：宁涓 申请学位级别：硕士 专业：血液科 指导教师：刘启发 20080415 硕士学位论文 a G V H D 在a l l o H S C T 后小鼠弥漫性肺 损伤的作用及机理研究 硕士研究生：宁涓 指导教师：刘启发教授 摘要 异基因造血干细胞移植( a l l o H S C T ) 是当今治疗恶性和难治性造血系统疾病 的重要手段，影响a l l o H S C T 后疗效的最主要原因仍是移植物抗宿主病( G V H D ) 和肺部并发症。a l l o H S C T 后约5 0 患者出现肺
2、部并发症，其中近一半患者因肺 部并发症而致死。移植后肺损伤按病因分为感染与非感染性肺损伤，按出现时 间早晚分为早期( 移植后1 0 0 天内) 和晚期( 移植后1 0 0 天后) 肺损伤。既往 约半数以上患者的肺损伤是因感染所致，但近些年因广谱抗感染药物的预防应 用，感染因素所致的肺损伤比例下降，而非感染因素成为肺损伤的最主要原因。 多数研究认为a l l o H S C T 后晚期非感染性弥漫性肺损伤由免疫异常所致，与慢性 G V H D ( c G V H D ) 有关，早期非感染性弥漫性肺损伤是否与急性G V H D ( a G V H D ) 有关尚存在争论。 目的： 通过建立小鼠a
3、l l o H S C Ta G V H D 模型，研究小鼠a G V H D 中肺脏损伤及其 损伤机理。 方法： 1 采用M H C 完全不相合的纯种近交系小鼠：供鼠为雄性C 5 7 B L 6 ( H 2 6 ) 鼠；受鼠为雌性B A L B e ( H 2 0 ) 鼠，建立a l l o H S C T 中a G V H D 动物模型。 2 移植预处理方案采用全身照射( T B I ) 8 。0 G y ，剂量率为O 5 G y m i n 。小鼠 随机分为三组：单纯照射( A 组) 、同基因骨髓移植( B 组) 、异基因骨髓移植( C 中文摘要 组) ，每组各3 6 只( 其中1 2
4、只用作a G V H D 模型的建立，2 4 只用作a G V H D 中 肺损伤研究) 。 3 三组小鼠的肺脏移植后第3 d 、第7 d 、单纯照射组第1 2 d ( 濒死前) 、同 基因移植组第1 2 d 和第1 4 d 、异基因移植组第1 4 d ( 发生a G V H D 后3 d ) 分别进 行C T 、病理组织切片，蛋白液相芯片技术检测移植受鼠肺脏细胞因子T N F a 、I F N T 的变化。 4 统计学分析 用S P S S1 3 0 软件包处理，小鼠存活时间采用KI n d e p e n d e n tS a m p l e sT e s t 分 析，利用K a p l
5、a n M e i e r 法绘制生存曲线；小鼠造血重建时间采用独立样本r 检验； 第3 d 、第7 d 细胞因子采用O n e w a yA N O V A 检验，第1 7 d 细胞因子采用独立样 本f 检验。P 墨0 0 5 表示差异有显著性意义。 结果： 1 小鼠a G V H D 模型建立： 造血重建：本研究动态观察结果表明：预处理3 d 后三组小鼠W B C l x l 0 9 L ，且单纯照射组W B C 始终 1 0 x 1 0 9 L 的时间分别为9 3 3 + 2 3 1d 、1 0 3 3 + 1 6 5d 俨值为0 5 0 1 ) ，两组 造血重建时间差异没有统计学意义。
6、 G V H D 的观察：三组小鼠照射后前6 d 变化类似：体重进行性下降，伴活 动减少，嗜睡，皱毛；弓背但无腹泻。单纯照射组小鼠第6d 开始死亡，死亡高 峰在移植后9 d 1 2 d ，第1 2 d 全部死亡；同基因移植组小鼠第7 d 起体重逐渐增加， 至移植后3 w 时体重恢复正常并继续增加，该组小鼠未出现a G V H D 的症状，全 部存活时间大于6 0 d ；C 组小鼠第7 d 1 0 d 体重略回升，1 1 d 后体重再度开始下降， 并1 1 d 左右再次出现活动减少，嗜睡，弓背，脱毛，腹泻典型G V H D 表现，死 亡高峰在移植后第1 5 1 7 d ，第1 7 d 全部死亡，
7、单纯照射组、同基因移植组小鼠 未发生a G V H D ，异基因移植组小鼠全部出现a G V H D 表现，发生率1 0 0 。 受鼠生存期观察：A 、B 、C 三组小鼠平均存活时间分别为9 6 7 士2 2 5d ；全 I I 硕士学位论文 部存活 6 0d ：1 5 1 7 - 4 - 1 3 3d ，三组间差异有显著性意义( 尸= O 0 0 0 ) 。 2 J 、鼠肺部影像学变化：第3 d 、第7 d 三组小鼠肺脏未出现影像学变化，单 纯照射组小鼠移植后第1 2 d ( 濒死前) 6 只有1 只出现双肺毛玻璃状渗出影，同 基因移植组第1 2 d 和第1 4 d 未出现影像学变化，异基因
8、移植组小鼠第1 4 d ( 发生 a G V H D 后3 d ) 6 只有4 只出现双肺毛玻璃状渗出影。 3 肺组织病理学结果：三组小鼠第3d 病变类似：肺脏上皮细胞轻度水肿、 肺泡壁水肿、散在淋巴细胞和巨噬细胞浸润，属于轻度问质性肺炎；单纯照射 组第7 d 肺组织病变：肺脏上皮细胞水肿、增生，肺间隔增宽；第1 2 d ( 濒死前) 肺组织病变：肺泡上皮细胞增生，肺泡腔出血、蛋白物渗出，肺部局部实变； 同基因移植组小鼠第7 d 肺组织表现：肺脏上皮细胞轻度水肿，较第3 d 病变减 轻；第1 4 d 肺组织恢复正常。异基因移植组小鼠第7 d 肺组织病变：肺脏出现毛 细血管高度扩张、充血，肺间隔
9、增宽、淋巴细胞浸润；第1 4 d ( 发生a G V H D 后 3 d ) 肺组织病变：肺脏出现肺水肿、上皮细胞增生，肺泡腔淋巴细胞、巨噬细 胞浸润，蛋白物渗出，肺间隔明显增宽、淋巴细胞浸润，出现小动脉炎、小静 脉周围炎症，属于局造性中度间质性肺炎。 4 利用蛋白液相芯片技术对三组小鼠第3 d 、第7 d 、第1 7 d 检测肺脏细胞因 子：细胞因子T N F n 在第3d 时三组分别为4 8 1 6 7 士7 6 7 9 ( p g m 1 ) 、4 8 6 6 7 士9 2 2 3 ( p g m 1 ) 、4 6 1 6 7 士4 7 9 2 ( p g m 1 ) ，三组比较差异没有
10、统计学意义( P = O 8 3 0 ) 3 第7 d 时三组分别为3 4 0 0 0 士2 6 0 8 ( p g m 1 ) 、4 5 5 0 0 + 6 8 9 9 ( p g m 1 ) 、6 2 5 0 0 - a ：6 2 5 3 ( p g m 1 ) ，三组比较组间差异有统计学意义( 尸= 0 0 0 0 ) ，异基因移植组明显高于 单纯照射组和同基因移植组；第1 7 d 时同基因移植组和异基因移植组分别为 51 16 7 + 4 2 6 2 ( p g m 1 ) 、6 3 6 6 7 - 4 - 1 2 2 4 2 ( p g m 1 ) ，两组比较差异有统计学意义( 尸
11、= 0 0 4 ) ，异基因移植组高于同基因移植组。细胞因子I F N ，在第3 d 时三组分别为 3 1 9 8 3 3 - 4 - 1 2 4 8 1 ( p g m 1 ) 、3 6 4 0 0 0 士6 6 7 9 8 ( p g m 1 ) 、3 8 2 0 0 0 士2 9 4 3 5 ( p g m 1 ) ，第7 d 时三组分别为3 9 7 5 0 0 士3 7 9 1 4 ( p g m 1 ) 、3 8 0 5 0 0 + 3 3 2 4 3 、3 9 9 8 3 3 + 2 9 9 6 8 ( p g m 1 ) ： 第3 d 和第7 d 三组I F N r 比较组间差异
12、没有统计学意义俨值分别为O 0 6 2 、0 5 7 1 ) 。 I I I 中文摘要 I F N T 在第1 7 d 时同基因移植组和异基因移植组分别为4 0 5 1 6 7 士2 3 9 2 8 ( p g m 1 ) 、 3 0 9 3 3 3 + 5 2 0 9 9 ( p g m 1 ) ，两组比较差异有统计学意义( 尸= 0 0 0 5 ) ，异基因移植组 低于同基因移植组。 讨论： a l l o H S C T 后约5 0 患者发生肺损伤，其中约一半患者因肺损伤而致死，近 年由于合理抗感染药物的预防措施，感染因素引起的并发症逐渐下降，而非感 染因素在移植后肺部并发症中占主导地位
13、。根据移植后发病时间分早期和晚期 肺损伤，该分类方法对疾病诊断具有一定的指导价值，因不同时间内其发病种 类有一定的规律性。按病因分为感染与非感染性肺损伤。非感染性肺损伤的内 涵指找不到明确的致病微生物且对抗生素治疗无效。非感染性肺损伤总体概括 可归纳为广义和狭义概念。广义是指：与造血干细胞移植可能有关的一切非感 染性原因引起的肺部并发症如：放疗、药物对上呼吸道粘膜损伤导致的炎症反 应如喉头水肿和移植后继发的肺部肿瘤等；狭义主要是指弥漫性肺损伤如：早 期并发症中的特发性肺炎综合症( I P S ) 、弥漫性肺出血( D A H ) 、植入呼吸窘迫 综合症( P E I m S ) 、窦状闭塞综合
14、症( S O S ) 、非心源性毛细血管渗漏综合症( C L S ) 和晚期并发症中的梗阻性细支器官炎( B O ) 和梗阻性细支器管炎并机化性肺炎 ( B O O P ) 。多数研究认为a l l o H S C T 后晚期非感染性弥漫性肺损伤由免疫异常 所致，大部分与c G V H D 有关。有关a G V H D 对肺脏损伤尽管早在1 9 7 8 年 B e s c h o r n e r 就在尸检病例中观察到a G V H D 与淋巴细胞细支气管炎有关，随后 G e r h a r d 在小鼠a G V H D 模型中观察到肺损伤是发生在a G V H D 的过程中，此后 许多文献证实
15、早期非感染性肺损伤与a G V H D 有关，但早期非感染性肺损伤是否 与a G V H D 有关仍存在争议。一些研究认为早期弥漫性肺损伤与a G V H D 无关， 其依据是：肺损伤由G V H D 所致肺组织病理中缺乏像皮肤、肝脏和肠道中典 型的凋亡现象；临床上a G V H D 肝、脾、皮肤表现与肺损伤存在不一致。而肯 定早期弥漫性肺损伤与a G V H D 有关是基于：肺部是机体免疫反应的重要场 所；肺组织中像皮肤、肝脏及肠道一样存在大量的抗原提呈细胞和M H C 抗原 I V 硕士学位论文 高表达；c G V H D 与晚期弥漫性肺损伤有关已得到肯定，这也间接提示a G V H D
16、可能对肺脏造成损伤。传统认为凋亡现象是a G V H D 特有病理表现，但胸腺是 a G V H D 作用的主要靶器官，在a G V H D 的胸腺中存在大量损伤细胞，但并无凋 亡现象；有关临床上a G V H D 肝，脾，皮肤表现与肺损伤不一致问题，最近C o o k e K R 等在动物实验中证实去T 细胞移植不存在a G V H D 的小鼠中也存在类似未去 T 细胞存在a G V H D 小鼠一样的肺损伤，这一结果提示在a G V H D 引起的肺损伤 其有可能不存在其它组织器官的a G V H D 表现；B o l a l l o s M e a d e 与K n o x 等分别 报道一例a l l o H S C T 和一例肝移植后患者表现为单纯性a G V H D 肺炎，而无肝、 脾、肠G V H D 表现，这些结果提示在a G V H D 引起的肺损伤其有
