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1、5生物工程进展62000,Vol.20,No.5 大豆的基因组研究 刘 峰 陈受宜(中国科学院遗传研究所植物生物技术实验室,北京 100101)大豆起源于中国,是具有重要经济价值的油料作物,也是食物中植物蛋白质的主要来源。其种子约含40%蛋白和20%脂肪。在国际贸易市场上,大豆的脂肪含量在主要油料作物中位居第一。目前,大豆已成为一种国际性作物,在美国、巴西、阿根廷、中国和印度等国家广为种植,其中美国的大豆产量最高(Singh等,1999)。大豆的基因组约为100Mb,其中60%左右是重复序列(Gurley等,1979)。其大小大约是拟南芥基因组的715倍,水稻的215倍,然而小于玉米基因组的一
2、半,为小麦的1/14(Arumanagathan和Raele,1991)。L.my十几年前我们对大豆基因组的了解还非常少。尽管已有250个形态和同功酶标记,但大部分不能定位。在分子图谱建成前,大豆中只有17个经典连锁群,包含57个标记,长度为(420cM(Palmer和Keim,1989)。大多数连锁群为两点或三点连锁。这与大豆的经济地位是不相称的。现在,大豆基因组的研究与以前的状况已大不相同,甚至可与许多模式植物相媲美。大豆基因组的时代是从发展分子遗传图谱开始的。遗传连锁图在许多研究领域中包括系统进化、分子标记辅助选择和基因的图位克隆等都发挥了巨大的作用。因此,对于得到广泛研究的重要经济作物
3、)大豆来讲,发展一张高密度的分子遗传图谱,其上包括许多具有可分辨表型效应的经典标记,同功酶标记和大量高信息度的DNA标记并且均匀分布在整个基因组中,将具有重要意义(表1,2)。在过去的十年中,应用美国北方和南方的大豆种质资源,分别发展了十多张遗传图谱,所用的作图群体有种间和种内杂交得到的群体、F2群体和重组自交系群体(Recombinant InbredLines,RIL)。1988年,Apuya等应用大豆两个栽培品种Min2soy和Noir 1杂交得到的F2群体构建了第一张大豆RFLP图谱,共有11个RFLP标记分布在4个连锁群上。随后,Keim等(1990)应用G. Max和G.Soja进
4、行种间杂交,构建了第二张RFLP图谱,该图谱包括130个RFLP标记组成的26个连锁群,覆盖V1 E2、vyFZ拟南芥水稻大豆染色体n= 5 n= 12 n= 20基因组大小130Mb 430Mb 1100Mb已定位的分子标记1000 2275 1387分子标记类型RFLP,CAPS,SSR,AFLP,RAPD RFLP, SSR,RFLP,SSR, AFLP,RAPDAFLP,RAPDEST 38, 000(24, 000 non2redundantsequences)35,000(3200个已定位)约20,000个已完成的基因组序列84Mb / /重复序列比例较少50% 40260%物理图
5、谱覆盖范围几乎全部(YAC) 70%(YAC)/图位克隆的重要基因12个5个无转化方法农杆菌基因枪,聚乙二醇(PEG),农杆菌农杆菌数据库网址http: Mgenome2www. stanford.edu/Arabidopsishttp: Mwww.staff.or.jp http: M129.186.26.9416V2 vL.m?Z时间作者作图群体连锁群总标记数总长度(cM)1988 Apuya etal F2 4 111990 Keimet al F2 26 130 12001993 Shoemaker& OlsonF2 25 383 30001993 Larketal F2 31 132
6、 15001995 Shoemaker& SpechtF2 26 138(104)1997 Keimet al RIL 28 840 34411999 Cregan etalF2 ( 2 ),RIL20 14231997张德水等F2 20 71 1446.81999刘峰等RIL 22 240 371315大豆基因组1200cM。Shoemaker和Olson(1993)同样使用G.MaxG.Soja杂交的F2群体,发展了含有25个连锁群的遗传图谱,包括365个RFLP标记,11个RAPD标记,3个经典性状标记和4个同功酶标记。大豆经典图谱共有68个位点分布在20个连锁群上,每个连锁群上只有几个
7、位点(Palmer和Shoemaker, 1998)。1995年, Shoemaker和Specht将来源于不同群体的各种标记整合到一张图谱上。他们用近等基因系ClarkHarosoy杂交得到的F2群体构建了一张含有13个经典标记,7个同功酶标记,110个RFLP标记和8个RAPD标记的遗传图谱。通过使用一套锚定的RFLP探针,根据其在上述群体和G.MaxG.Soja两个群体中的分离,确定了分子和经典图谱的同源连锁群。Keim等(1997)应用BSR- 101PI437.654构建的含有300个单株的RIL群体,构建了RFLP框架图,然后选取其中42个RIL株系进行AFLP标记的遗传作图,构建
8、了含有28个连锁群的遗传图谱,长度为3441cM。共有165个RFLP,25个RAPD,650个AFLP标记。尽管AFLP经常成簇排列,相对于其它分子标记,AFLP更均匀地分布在所有连锁群中。1999年,Cregan等应用606个SSR标记,同时对三个作图群体,USDA/IOWA G.maxG.soja的F2群体,Univ.OfUtahMinsoyNoir1的重组自交系和Univ.OfNebraskaClarkHarosoy的F2群体,进行作图。大多数SSR标记在两个或三个群体的亲本中都具有多态性。这些图谱上总标记数(分子标记,同功酶和经典标记)分别为703(G.maxG.soja),539(
9、MinsoyNoi 1)和460(ClarkHarsoy)。由于SSR位点的特异性,因此可以将三个群体分别构建的遗传图谱整合成一张遗传图谱,含有20个同源连锁群,对应于大豆单倍体基因组中的20条染色体。大豆中报道的全部经典连锁群除了CLG06以外都整合进这张图谱中。综合这三张图谱,特异位点的总数为1423个,其中有606个SSR, 689个RFLP,79RAPD,11个AFLP,10个同工酶和26个经典标记。发展这些遗传图谱的同时,也发展了各种类型的分子标记。现已定位了几百个RFLP探针和RAPD标记(Lark等, 1993; Rafalski和Tingey,1993;Shoemaker等,
10、1995), 600多个AFLP标记(Keim等,1997)和大约600多个微卫星标记(Cre2gan等,1999)。基因组的比较遗传作图研究发现禾谷类具有高度保守的基因组结构,据此提出禾谷类具有一个共同的祖先基因组假说。这在基因组信息从一个禾谷类品种到另一个品种的交流方面具有重要意义(Bennetzen和Freeling,1993)。然而豆科植物中的比较作图则较为复杂。大豆在二倍化过程中发生的大量DNA重排事件使其很难鉴定其与相关豆科植物间具有共线性的染色体区段(Boutin等,1995)。绿豆(2n= 11)和菜豆(2n= 11)都属于Phaselus属,表现出高度的保守性和标记间顺序的相
11、似性,绿豆的大多数连锁群含有一个或几个来自菜豆的连锁区段,但与大豆(2n= 20)比较时则大不相同,前二者的连锁群上通常只有较短的大豆连锁区镶嵌其中。vB8尽管使用了不同的群体和各种类型的分子标记发展大豆遗传图谱,但在进行不同群体的图谱比较时,仍存在一些模糊的问题。这主要是由基因组本身的复制和RFLP探针通常只能检测众多复制位点中的一个引起的。对大豆基因组的内在结构进行分析,揭示了一些关于基因组进化和基因表达的有趣现象。很明显,远祖时期,大豆发生了某种类型的多倍体化。大豆二倍体的染色体数目为2n= 40,然而Phaseolae亚科的大多数属为2n= 22。Lackey(1980)据此推断, G
12、lycine可能来源于一个二倍体的祖先(n= 11),随后产生非整倍体的丢失导致n=10,进而多倍体化成为现在的2n= 40。如下所示:2n= 22染色体丢失2n= 20多倍化4n= 40二倍体化2n= 40然而,尽管其为多倍体,大豆基因组的绝大部分17在行为上仍表现为二倍体。多倍体的/二倍化0是一个典型进化事件,通常是由于增加、缺失、突变和重排等快速抑制了连锁群的非同源配对引起的(Ohno,1970)。有许多证据证明大豆实际上是一个古四倍体。在大豆种质库中,发现了许多重复基因,即两个独立的基因控制相同的性状(Palmer和Kilen,1987)。例如:pal/pa2(软毛的直立和平贴生长),
13、pd1/pd2(正常/密集的软毛),d1/d2(种胚色)和y7/y8(绿/黄簇叶)。根据它们在F2群体中呈现的15B1分离比,确定它们为重复基因。另外,对基因组的分子遗传分析提供了基因组复制的最直接的证据。Shoemaker等(1996)对280个随机挑选的PstI基因克隆与完全酶切的大豆基因组DNA进行Southern分析得到的平均杂交条带数目的分析显示了基因组中大量的复制现象。有90%以上的探针检测到2条以上的条带,近60%检测到3条或以上的条带。这说明基因组中仅为单拷贝序列的部分不到10%。基余大部分可能不仅四倍化,还经历了基因组复制。对基因组中复制片段线性结构的全面分析和不同来源数据的
14、整合也支持这一观点。对来自9个不同群体的800多个标记综合分析得到一张整合图谱,通过RFLP杂交技术检测到广泛的同源关系(Shoemaker等,1996)。复制片段平均长度为45cM,个别的超过100cM。复制区段平均复制了2155次,有的达到6次。另外,还发现/巢式0复制,说明其中大豆的一个原始基因组可能在进化过程中又进行了额外的四倍体化。大豆基因组中序列的复制,不能简单地解释为四倍体化事件。例如,对于任一连锁群,其上定位的标记也可以在其它多个连锁群中检测到。一个中等大小的连锁群上包含能在另外8个连锁群上同时检测到的标记。这说明,四倍体化和片段复制可能不是产生基因组复制的唯一机制。如上所述,
15、由于基因组序列的复制,在整合RFLP数据时产生了困难。因为一个RFLP探针在基因组中可检测到多个位点。在一个群体中用某一探针检测到的多态性片段代表了一个位点,而相同探针在另一群体中检测到的多态性片段可能代表了另一个完全不同且不连锁的位点。这与不同群体中哪一个位点具有多态有关。虽然通过使用/锚定0的探针/酶组合(特定的探针/酶组合确定了相同的多态性位点,从而在图谱上定位在相同的位置),可以克服这一困难,然而最终解决此问题,只有发展信息度高且只有单一位点的分子标记)微卫星标记(刘峰等,1998)。如上所述,Cregan等(1999)根据600多个单一位点的微卫星标记在2到3个群体的分离数据,将连锁
16、群整合成一张公共图谱,含有20条连锁群,覆盖长度为2750cM。包含预期的20个连锁群的遗传图谱的建成将成为大豆基因组研究中重要的里程碑。jy分子遗传图谱只有能准确定位基因或QTL,才能得到充分利用。通常一次试验只能分析一个性状。然而Shoemaker等(1995)在一次实验中定位了18个基因,这是通过在用以作图的亲本中积累突变完成的。由于大部分基因已定位在经典连锁群上,通常多数经典连锁群在一次试验中就能整合在相应的分子遗传图谱上。目前,已定位了60多个质量性状位点。除了许多抗病基因或/质量性状0基因外,大多数重要农艺性状是由几个或多个基因共同控制的(数量性状)。控制这种性状的基因座位称为数量性状基因位点(quantitativetrait loci,QTL)。由于大多数数量性状存在遗传与环境的互作,数量性状的育种需要在多个地点进行两年或更长时间的田间重复实验。显然这个
