《尖孢镰刀菌寄主专化型电子舌鉴别模型的建立》由会员分享，可在线阅读，更多相关《尖孢镰刀菌寄主专化型电子舌鉴别模型的建立（20页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1尖孢镰刀菌寄主专化型电子舌性脂肪酸判别鉴别模型的建立 刘波*，肖荣 凤， 朱育菁，胡桂萍（福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建 福州 350003）摘要：应用基于通过微生物细胞脂肪酸成分鉴定的全自动微生物鉴定系统(Sherlock MIS)，检测分析不同寄主尖孢镰刀菌中脂肪酸的生物标记结构组成和的分布特性。，从供试的 22 个菌株中检测到 8 种脂肪酸，其中常见脂肪酸有 6条，含量 60%以上的主要脂肪酸 脂肪酸 有 16:0、18:0 和 18:2 CIS 9,12/18:0a 在所有的菌株中都存在，各菌株中 3 种脂肪酸之和占总脂肪酸含量的 60%以上，为主要脂肪酸 。对常见脂肪酸进
2、行 通过系统聚类分析，可将 26 个菌株分为 3类。各类群的划分结果显示仅与脂肪酸生物标记在各菌株中的存在情况相关，而常见脂肪酸与菌株的来源、和生化型、致病型进化演变等无有对应关系。对常见脂肪酸进行主成分分析得到尖孢镰刀菌脂肪酸中的特征脂肪酸有 5 个，分别为 14:0（X1），16:0(X2) ，16:1 CIS 9 (W 7)(X3)，18:0(X4) 和 18:2 CIS 9,12/18:0a(X5)。对尖孢镰刀菌特征脂肪酸进行 Bayes 逐步判别分析得到尖孢镰刀菌寄主判别模型为 Y1=-183.06+12.24X1+ 8.05X2+5.39X4+3.58X5，Y2=-174.09+1
3、0.40X1+7.96X2+5.40X4+3.42X5，Y3=-173.97+14.85X1+7.25X2+6.58X4+3.53X5，当 1Yi2 时，菌株的寄主为西瓜； 当 2Yi3 时,菌株的寄主为香蕉；当 Yi3 时，菌株的寄主为花生，且模型判对的概率为 0.90909，说明脂肪酸 14:0， 16:0， 18:0， 18:2 CIS 9,12/18:0a 是判别尖孢镰刀菌寄主的四个重要指标，同时该模型比较符合实际，有很好的应用价值。关键词：尖孢镰刀菌；脂肪酸；寄主；判别模型Abstract:Characteristics of PLFA biomarkers in Fusarium
4、oxysporum Schl. were study by means of microbe identification system (MIDI system from USA), The results showed that 8 fat acids were identified in 26 strains,there were fat acids 16:00、18:00 and 18:2 CIS 9,12/18:0a in all strains. Using the cluster analysis method the 26 strains were classified int
5、o 4 groups based on the PLFAs biomarkers,and had no association with origin, biochemical variant and pathotype of Fusarium oxysporum Schl.Key: Fusarium oxysporum Schl.；fat acid ；host ; the discriminant model 尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）引起的农作枯萎病是一种世界性分布的土传真菌病害，寄主范围广泛，可引起100多种植物发病，造成严重减产，甚至绝收。尖孢镰刀菌
6、由致病菌株与无致病菌株组成，种内的致病菌株具有高度的寄主专化性，根据对不同寄主植物的专化性可分为专化型，在同一尖孢镰刀菌不同的的专化型，引起的发病程度完全不同，如尖孢镰刀菌西瓜专化型就不会侵染黄瓜专化型，同样，尖孢镰刀菌古巴专化型只会侵染香蕉而不会侵染花生作物下面。，根据致病力的差异又划分为许多生理小种。尖孢镰刀菌专化型致病型的监测是研究病原菌群体结构的一收稿日期： 接受日期：基金项目：国家高技术研究与发展计划（863 ）项目（2006AA10A211 ）；福建省财政专项- 福建省农业科学院科技创新团队建设基金(STIF-Y03)；福建省发改委重点项目（闽发改投资 2006781 号）。福建省
7、自然科学基金：非致病性尖孢镰刀菌对西瓜枯萎病的免疫抗病机制研究（2008J0055）作者简介：蓝江林（1972-），博士，副研究员，研究方向：生物技术与生物防治。电子邮件： 。电话：0591-87848933。通讯作者：刘波，博士，研究员。研究方向：生物技术与生物防治。电子邮件：。电话：0591-87864601。2项重要措施，为病害的防治提供可靠的病原菌信息，并可为抗病育种提供抗性基因。植物病理学家和育种学家认识到病原真菌的变异对寄主植物抗性的有效性和持久性非常重要，病原真菌的基因型与特定的寄主植物基因型相互作用可导致抗病性在很短时间内丧失【BROWN J K，1996】。然而，鉴定尖孢镰刀
8、菌的专化型，方法复杂、时间很长、实验难度较大。电子舌技术是一种由气相色谱仪和判别模型组成的脂肪酸物质差异分析机构，能识别单一的或混合的脂肪酸溶液。不同的尖孢镰刀菌专化型其脂肪酸种类和组成存在着差异，为电子舌技术作为尖孢镰刀菌专化型识别的工具提供了条件。作者提出利用电子舌技术，“舔”出由气相色谱分析的尖孢镰刀菌脂肪酸组成差异，建立判别模型，鉴别尖孢镰刀菌的专化型。电子舌技术是一种由气相色谱仪和判别模型组成的脂肪酸物质差异分析机构，能识别单一的或混合的脂肪酸溶液。不同的尖孢镰刀菌专化型其脂肪酸种类和组成存在着差异，为电子舌技术作为尖孢镰刀菌专化型识别的工具提供了条件。尖孢镰刀菌微生物细胞结构中普遍
9、含有的脂肪酸成分，并与微生物 DNA 具有高度同源性，各种尖孢镰刀菌微生物专化型具有其特征性的细胞脂肪酸指纹图谱【杜宗敏，2003】，因此，脂肪酸脂类早在 60年代脂肪酸就开始作为标志物用于细菌尖孢镰刀菌鉴定了【刘志辉，2005】。同时微生物脂肪酸中含多种有对植物病原菌拮抗作用的抗菌脂肪酸( Choudhury et al., 1994; Benyagoub et al., 1996; Cantrell et al., 2008)。抗菌活性脂肪酸尤其对真菌性病原菌如链格孢属（ Alternaria solani）刺盘孢属（Colletotrichum lagenarium） 镰刀菌属（Fusa
10、rium oxysporum f. sp）,镰刀菌属（ Fusarium oxysporum f. sp lycopersici）有抑制作用，对病原菌菌丝体生长和孢子萌发都有很强的抑制作用( Liu et al., 2008)。尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的脂肪酸主要是包括 C8 到 C24(Joshi and Mathur, 1987)。，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的脂肪酸组成 其中最主要的成分为 18:1 9 c, 16: 0 和 18:0，.占总脂肪酸的 47%，其他的脂肪酸含量低，主要为 -羟基，支链，二不饱和和奇数脂肪酸( Ellis e
11、t al., 2002)。镰刀菌（Fusarium oxysporum 和 Fusarium roseum）的菌丝体和孢子的脂肪酸包括了主要脂肪酸 18:1, 18:2, 和 16:0 和微量脂肪酸 18:0, 18:3, 和 14:0(RAMBO AND BEAN, 1969)。尖孢镰刀菌专化型脂肪酸的组成和含量不仅与菌株的生长温度有关( BARRAN AND MILLER, 1976)。尖孢镰刀菌专化型，其脂肪酸的组成结构还取决于菌株培养条件的 C 和 N 组成( JOSHI AND MATHUR, 1987)。 JOSHI AND DHAR, 1987 尖孢镰刀菌专化型脂肪酸合成一种从
12、FUSARIUM OXYSPORUM F. SP. LINI 分离到的脂肪酶对棉籽油中脂肪酸，坚果油中脂肪酸和尖孢镰孢菌分泌的饱和脂肪酸具有水解作用，显示对尖孢镰孢菌专化型分泌的饱和脂肪酸具有优先特异性( JOSHI AND DHAR, 1987)，形成了对寄主特异性选择( JOSHI AND DHAR, 1987)。这一原理，为利用电子舌技术分析尖孢镰刀菌专化型提供了基础。目前，目前脂肪酸生物标记分析较少应用于农业病原真菌的研究，对于尖孢镰刀菌专化型的镰刀菌脂肪酸组成差异研究多集中外界环境如温度，培养基，PHpH 值等的影响，而对于由于镰刀菌自身差异，如专化型寄主来源不同引起差异的研究较少。
13、到目前为止，未见关于利用电子舌技术识别尖孢镰刀菌专化型脂肪酸差异的研究的报道。目前利用判别分析法，根据不同寄主镰刀菌的脂肪酸结构特点建立镰刀菌寄主的专化型脂肪酸判别模型的报道还未见。本研究旨在对本研究室从不同寄主分离获得的尖孢镰刀菌，进行脂肪酸气相色谱典型的模式图谱及菌株脂肪酸峰值变化规律分析，为建立电子舌技术尖孢镰刀菌专化型脂肪酸判别模型提供依据，为仪器化鉴别尖孢镰刀菌专化型菌株的脂肪酸种类组群是否与专化型、生理小种、营养亲和群等生理指标具有相关性奠定基础，并建立尖孢镰刀菌寄主专化型脂肪酸判别模型，为尖孢镰刀菌寄主专化型的判定提供新的思路和方法。1 材料与方法1.1 材料3供试菌株，不同来源
14、分离纯化的尖孢镰刀菌 22 株，见表 1。 SDB 培养基：30 g Sabouraud Dextrose Broth（ SDB）+蒸馏水 1000 mL。（SDB 购于 Fisher 公司）。皂化试剂：氢氧化钠 45 g+甲醇150 mL+水 150 mL。甲基化试剂：6N 盐酸 325 mL+甲醇 275 mL。萃取试剂：正已烷 200 mL+甲基叔丁基乙醚 200 mL。洗涤试剂：氢氧化钠 10.8 g+水 900 mL。表 1 供试尖孢镰刀菌菌株寄主 菌株编号 采集地点 专化型 致病型1. 西瓜 134 永泰 西瓜专化型 致病2. 西瓜 136 永泰 西瓜专化型 致病3. 西瓜 137
15、 永泰 西瓜专化型 致病4. 西瓜 138 永泰 西瓜专化型 致病5. 西瓜 140 永泰 西瓜专化型 致病6. 西瓜 141 永泰 西瓜专化型 致病7. 香蕉 378 漳州 古巴专化型 致病8. 香蕉 384 漳州 古巴专化型 致病9. 香蕉 386 漳州 古巴专化型 致病10. 香蕉 387 漳州 古巴专化型 致病11. 香蕉 389 漳州 古巴专化型 致病12. 香蕉 391 漳州 古巴专化型 致病13. 香蕉 392 漳州 古巴专化型 致病14. 花生 816 泉州 致病15. 花生 833 惠安 致病16. 花生 834 惠安 致病17. 花生 836 惠安 致病18. 花生 841
16、 惠安 ？ 致病19. 花生 846 惠安 致病20. 花生 847 惠安 致病21. 花生 855 惠安 致病22. 花生 866 惠安 致病1.2方法（1）尖孢镰刀菌脂肪酸的提取和气相色谱分析脂肪酸提取所用的试剂：包括脂肪酸甲酯混合物标样（由美国 MIDI 公司提供）、菌落收集培养基（TSBA 培养基）、脂肪酸提取所需试剂皂化试剂、甲基化试剂、萃取试剂和洗涤试剂 （美国Fisher 公司提供），除脂肪酸甲酯混合物标样为直接应用外，其它试剂配制由 MIDI 公司提供；脂肪酸的提取包括菌落收集、细菌脂肪酸皂化释放、脂肪酸的甲基化、脂肪酸甲酯萃取和基本洗涤等步骤，具体操作由 MIDI 公司提供。在色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本，色谱条件如下：二阶程序升高柱温，170起始，5/min 升至 260 ，而后 40/min 升温至 310 ，维持 90S；汽化室温度 250、检测器温度 300；载气为氢气(2mL/min)
