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1、对骨桥蛋白（OPN）基因与动物繁殖性能的相关性的研究刘庆雨，张树敏，金 鑫，李 娜，李兆华，赵晓东，张志彬（吉林省农业科学院，公主岭 136100）摘要：骨桥蛋白是一种重要的组织营养物质，在动物生殖过程中发挥着重要作用。本文就OPN 的分子结构、OPN 的生物学功能、 OPN 基因的表达调控以及 OPN 基因多态性与动物繁殖性能的关系作一综述。关键词：骨桥蛋白；动物；繁殖性状骨桥蛋白又名骨调素，是富含唾液酸及多个糖基化位点的磷酸化蛋白，属于细胞外基质蛋白的一种，其分子量在 66Kd 左右，首次由 Franzen 等在骨基质中发现，因其在骨组织细胞之间及细胞与基质之间的连接左右而被命名为骨桥蛋白
2、，其早期也被人称为骨唾液酸蛋白 1、磷蛋白 1、淋巴蛋白活性 1 及骨延蛋白 1 等 1。骨桥蛋白在妊娠初期的胚胎着床、血管细胞的重建、肿瘤的生长及转移、骨生成及代谢等多种生理及病理功能都有着重要作用，因此很多研究认为骨桥蛋白也是一种细胞因子。1.1 骨桥蛋白的分子结构骨基质蛋白主要由胶原蛋白及非胶原蛋白两种成分构成，骨桥蛋白则是非胶原蛋白中的重要成分之一，骨桥蛋白的分子内部含有多个精氨酸-甘氨酸- 天冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列，该序列是细胞黏附分子的特有结构，对不同种类的细胞具有一定的黏附能力，MILLSEN 等的研究发现含有 RGD 序列的骨桥蛋白可以促进成骨细胞的黏附、
3、分裂、增殖及分化等。骨桥蛋白主要通过与其受体结合发挥作用，骨桥蛋白的受体分为整合素受体蛋白及 CD44 两大类，整合素受体蛋白一般只由 亚基及 亚基构成，与骨桥蛋白结合的整合素受体有 V 1、 V 3、 V 5、 4 1、 9 1，其中 V 3 是与骨桥蛋白结合的主要受体。骨桥蛋白与不同的整合素受体结合发挥不同的作用 2，研究发现骨桥蛋白与 V 1、 V 5 结合将促使平滑肌细胞黏附，而与 V 3 的结合将促进该细胞的转移。相关研究也表明受体 V 3 与骨桥蛋白的结合具有一定的钙依赖性，骨桥蛋白与该受体之间的作用受到钙离子浓度的调节。受体 CD44 是一类位于细胞膜表面的粘性糖蛋白受体，该受体
4、与骨桥蛋白结合作用于多种细胞，促进细胞发挥重要功能。如骨桥蛋白只有与 CD44 受体结合才能对 IL-3 依赖细胞的凋亡具有一定的拮抗作用 3。骨桥蛋白分子中具有与凝血酶及部分金属蛋白酶作用的酶切位点，该位点通常被称为RS 位点， RS 位点位于 RGD 下游 6 个氨基酸处。凝血酶可将骨桥蛋白分子酶切成 45KDa和 24KDa 两个多肽片段 4,5，将 C 端的作用位点和 N 端的受体结合位点进行分离，将此位作者简介：刘庆雨（1986-） ，男，硕士研究生，研究方向：动物遗传育种与繁殖。Email:点上的 RGD 序列释放出来，使 45KDa 的多肽片段比骨桥蛋白更能刺激细胞的黏附和迁移6
5、。 骨桥蛋白分子通常以磷酸化 OPN 及非磷酸化 OPN 等多种形式存在组织及细胞中，磷酸化修饰对于骨桥蛋白的作用及活性都将产生重要的影响。骨桥蛋白广泛分布于人、牛、猪、鸡、兔、小鼠、大鼠等多种动物中，不同种属动物来源的 OPN 具有高度同源性，氨基酸序列大小在 264314 个氨基酸之间，这些物种中氨基酸的相似度在 35%86%之间，但都有包括 N 末端的信号肽序列、 C 末端的连续 ASP 序列及 50 个氨基酸 RGD 和酪氨酸激酶磷酸化识别序列的高度保守序列。研究表明人的骨桥蛋白基因位于 4q13 染色体上，长度为 8kb 左右，包含 7 个外显子（exon）及 6 个内含子（Intr
6、ons ），而小鼠与猪的骨桥蛋白基因都由 6 个 exon 及 5 个 Introns 构成，小鼠的 OPN基因定位在 5 号染色体上。1.2 OPN 的表达调控骨桥蛋白广泛分布于动物机体的多个组织细胞中，OPN 最早在牛的成骨细胞及破骨细胞中被发现，随后又发现骨桥蛋白可在肝、睾丸、胎盘、胰腺、骨、肾、肺、卵巢等组织和骨细胞、巨噬细胞、成骨细胞、破骨细胞、软骨细胞、激活的 T 细胞和病理状态下的癌细胞等多种细胞中表达。骨桥蛋白基因受多种因素的调控：（1）炎症反应期间，IL-1、TNF- 和 PDGF 可以通过活化 PKC 而刺激 OPN 的表达；（2）肝素结合表皮生长因子（HB-ECF） 、孕
7、激素（MPA ）能够引起骨桥蛋白表达量上调 7；（3）适宜浓度的水草酸钙 (calcium oxalate monohydrate,COM)对大鼠的肾小管上皮细胞刺激后，该细胞中的骨桥蛋白表达量增强，但过高浓度的 COM 会损坏上皮细胞，而导致骨桥蛋白表达量降低 8。 （4）H 2O2 能在基因水平上调节血管平滑肌细胞(VSMC)的 OPN 的表达 9；（5）脂多糖(LPS)可作用于腹膜间皮细胞( RPMC)，刺激该细胞内的骨桥蛋白表达量增加 5；（ 6）高纳盐能够对肾或培养的肾细胞中 OPN 表达增强，而缺钠也将减少肾中骨桥蛋白的表达。1.3 骨桥蛋白的生物学功能1.3.1 骨桥蛋白作为调控
8、因子参与动物创面损伤的修复过程 10。1.3.2 重组的 OPN 能够通过肾组织中中性粒细胞的聚集，而降低炎症反应的强度，从而证明了骨桥蛋白对中性粒细胞的调理功能。1.3.3 与骨的羟基磷灰石基质中的富含天冬氨酸（a spartic acid , Asp）的序列结合，刺激骨组织的矿化 11。1.3.4 参与调节骨基质矿化功能 12。1.3.5 参与降低一氧化氮合酶( inducibleNOS, iNOS)的转录，从而对炎症反应进行抑制 13。1.3.6 与整合素受体 3 结合，对 VSMC 进行调节，从而调节血管的重塑进程 14。1.3.7 参与胚胎着床及胚胎发育的过程，是子宫内膜基质蜕膜化的
9、标志。1.3.8 参与调控缝牵张成骨过程1.3.9 通过与 V 3 或其它未知受体结合，介导细胞与细胞信息的传递，对胞内钙离子浓度、NO 水平等产生影响，从而影响某些特异基因的表达。1.4 骨桥蛋白基因与繁殖哺乳动物的子宫、输卵管、睾丸、胚胎等与繁殖相关的组织中都能分泌骨桥蛋白，Waterhouse P 等在研究骨桥蛋白对胚胎发育的影响时，发现骨桥蛋白在子宫上皮中也存在15。随后研究人员通过对妇女子宫内膜不同时期骨桥蛋白表达量进行研究发现，分泌期骨桥蛋白的表达量较多，而增生期的子宫内膜中没有检测到骨桥蛋白的表达 16。Montgomery等(1992)认为 Brooloola 羊的显著的多产性
10、主要是由一个 FecB 主基因控制的，后经研究发现骨桥蛋白基因与 FecB 相连锁 17，首次表明 OPN 基因是影响动物繁殖性状的候选基因。Glasser 等通对狒狒蜕膜的研究，确认骨桥蛋白基因是蜕膜化的标志基因之一。胚胎着床是胚胎外层细胞与子宫内膜上皮的滋养层细胞相互黏附和侵入的一个复杂过程，是哺乳动物繁殖过程中极其重要的环节。Briese 等研究发现在绒毛膜滋养层、绒毛外滋养细胞、孕早期细胞滋养层及胎盘中都存在骨桥蛋白，并且其与胚胎着床过程中胚胎滋养层侵入子宫内膜的深度存在着明显的相关性，表明 OPN 对胚胎着床过程中胎盘形成具有一定的作用 18。Kao 等运用基因芯片技术对子宫内膜的容
11、受性进行了研究，结果表明在胚胎着床窗口期骨桥蛋白基因的表达明显增强，分泌中期达到最高 19。冉静等对妊娠期小鼠的子宫及胎盘中骨桥蛋白基因的表达规律进行了研究，发现小鼠整个妊娠期中母胚界面的蜕膜和 LE 上都存在骨桥蛋白，蜕膜中的骨桥蛋白在孕 D12.5 时表达量达到高峰，而后逐渐降低，但到 D18.5 时又小幅增加。这说明了骨桥蛋白在妊娠初期母体胎盘的信息传递过程中有着重要作用。子宫内膜滋养层表皮细胞的骨桥蛋白在孕 D9.5 时能够微弱的检测到，随后表达量逐渐增加，到孕 D18.5 时表达量达到高峰，说明了骨桥蛋白对于促进小鼠胚胎的发育及妊娠的维持具有重要作用 20。Garlow 等对母猪妊娠
12、的不同时期母体 -胎盘的交界面中骨桥蛋白基因的表达规律进行了研究发现，在母猪妊娠期的第 12 天，该界面上只能检测到少量骨桥蛋白的表达，到妊娠第 15 天时部分区域的表达开始增多，20 天时该界面及子宫内膜的滋养层细胞中骨桥蛋白基因都大量表达 21。骨桥蛋白的这种表达规律与猪妊娠 1224 天胚胎着床后母体及胎盘发生的一系列生理变化相对应，说明骨桥蛋白对胚胎着床后胎盘的形成及生长发育、母体与胚胎之间的联系及妊娠的维持有着一定的作用。骨桥蛋白基因对受精过程也具有重要的作用，主要包括促进顶体反应及透明带的溶解。Fernandez MS 等研究表明骨桥蛋白对配子受精、受精卵的卵裂及胚胎发育过程具有一
13、定的刺激作用 22。 Souza CE 等利用骨桥蛋白对牛的配子进行了预处理观察其对体外受精、受精卵的卵裂及胚胎生长发育的影响，结果发现骨桥蛋白对这些繁殖过程具有一定的促进作用。1.5 骨桥蛋白基因与繁殖性状许多研究都表明骨桥蛋白基因与动物的繁殖性状有一定的相关性。猪的骨桥蛋白基因是有 6 个外显子及 5 个内含子组成，该基因被定位在猪的 8 号染色体上，并发现该基因的启动子区域存在七种重复片段的双核苷酸序列 23,24。Short 等以 3 个梅山猪的合成系为研究对象对骨桥蛋白基因启动子区域的微卫星位点进行了研究，发现等位基因 4、5、6 对总产仔数及产活仔数的增多有影响 25。Southu
14、ood 等也进行了相关研究发现白猪品系和梅山猪合成系中 5 个等位基因与产仔数存在显著相关(P0.05)，这与 Van der steen 等对梅山猪合成系的研究相一致 26。孟庆利等以 41 头苏钟猪和 52 头二花脸猪为研究材料对骨桥蛋白基因启动子区域进行了研究，发现该区域存在一个微卫星位点，二花脸猪 158/142、170/152 和168/140 三种基因型的总产仔数之间存在显著差异 (P0.05)，152/170 和 158/142 基因型的产活仔数有显著差异性(P0.05)；初产苏钟猪的 164/168，140/152、152/170 以及 142/168 基因型的产活仔数之间的差
15、异显著 (P0.05)，经产苏钟猪的 152/170 和 130/142 型的总产仔数也存在显著差异 27。吴井生等对小梅山猪的骨桥蛋白基因进行了研究，结果发现在 P1位点（启动子区域）有一个微卫星位点，这与孟庆利的研究相一致，另外在内含子 1 上发现 2 个多态性位点，进一步研究表明该微卫星位点上不同的基因型母猪的总产仔数和产活仔数之间差异显著（P0.05） ，在 P3 位点上，不同基因型的总产仔数和产活仔数的差异显著（P0.05） ，其它繁殖性状之间的差异不显著；在 P5 位点上不同基因型的小梅山猪和大白猪的总产仔数和产活仔数的差异都不显著 28。谢畅等（ 2011）以山羊为研究材料对骨桥
16、蛋白基因的多态性与胎盘效率、繁殖性能进行了相关研究，发现在山羊的启动子区、第 6外显子区及第 7 外显子区存在 3 个 SNP 位点，但都只检测到了 AA 和 AB 两种基因型，经最小二乘分析后发现启动子区域的 SNP 位点中，在母羊的窝产仔数及初生重两个繁殖性状中 AA 基因型都显著高于 AB 基因型(P0.05)，第 6 外显子上的 SNP 位点对山羊的繁殖性能无显著影响；第 7 外显子 AA 型母羊的胎盘重、子叶重、窝产子数、出生窝重都显著或极显著高于 AB 型，说明该突变位点与山羊的繁殖性状及胎盘性状存在显著相关 29。这些研究都表明骨桥蛋白基因多态性比较丰富，且与动物的繁殖性状存在一定的相关性。参考文献1 孙晓炜.骨桥蛋白与胚泡着床J.生殖与避孕,2005,25(12):7
