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1、狂犬病病毒培养技术研究进展 作者： 日期：2 狂犬病病毒培养技术的研究进展狂犬病作为一种几乎100%致死的人兽共患传染病，对人类的危害已经存在了4000多年，至今仍无有效的治疗药物，可行的控制策略只有暴露前免疫和暴露后预防。其中暴露前免疫主要是针对动物而言，因为人的狂犬病来源于动物，只要动物的狂犬病免疫预防有效，可完全控制人狂犬病的发生；而暴露后预防主要用于人，因为人一旦被带毒动物咬伤，必须及时进行全程的暴露后预防才能防止感染狂犬病病毒。不论是暴露前免疫，还是暴露后预防，都离不开安全、有效、廉价的疫苗。人和兽用狂犬病疫苗的发展，都依赖于病毒培养技术的不断进步，尤其是微载体、发酵技术和无血清培养
2、基的广泛应用，把狂犬病病毒的增殖滴度提高到了一个新的水平，同时降低了生产成本，从而使高质量的细胞纯化疫苗逐渐占领市场。无论是传统的体内培养技术，还是现在的细胞培养技术，以及新型的细胞发酵和生物反应器，目前都广泛应用于狂犬病病毒的实验室研究或疫苗生产。本文主要就狂犬病病毒培养技术的发展和新技术的应用现状综述如下。1 体内培养技术体内培养技术利用了狂犬病病毒的嗜神经特性，具有敏感性好的优点，可以提高病毒检测的阳性率，而且易于操作，适用于不具备组织培养条件的实验室。其中，小鼠脑内接种是实验室最常用的狂犬病诊断和病毒培养技术之一，其他动物如大鼠、羊、兔等，过去主要用于狂犬病神经组织疫苗的生产。禽胚胎培
3、养技术主要是利用鸭胚和鸡胚进行狂犬病病毒培养，如鸡胚传代致弱的Flury-HEP、Flury-LEP和Kelev毒株。1.1 脑内培养技术小鼠脑内接种是最常用的狂犬病病毒脑内培养技术，最早用于狂犬病野毒株的分离培养是在1925年5。1955年，该技术开始用于疫苗生产，Fuenjalida和Palacios用新生鼠脑制备出人用组织疫苗（SMBV），该疫苗曾在南美洲使用了40多年，最终因使用后会引起严重的神经综合症而被迫停产1，但是小鼠脑内接种技术却一直延用至今。目前，该技术已成为病毒分离、毒力测定及中和试验等的常用方法，所用动物一般为小鼠，乳鼠对狂犬病病毒脑内接种的敏感性高于幼鼠和成年鼠6。小鼠
4、中，以瑞士白化鼠（Swiss albino）为首先品种，该品种小鼠在实验室饲养容易，对狂犬病病毒高度敏感，但迄今尚未发现任何对狂犬病病毒具有遗传抗性的小鼠品系，因此也可使用其他品种的小鼠。实验室一般不采用野生灰鼠或家鼠，因为其野性较大，人工饲养困难。狂犬病脑内接种试验周期长，通常需观察21天，且成本较高，操作技术性强，鉴于此，有的实验室已改用细胞（如小鼠成神经瘤细胞和BHK细胞等）代替小鼠进行试验。其他脑内培养技术（大鼠、羊、兔等动物的脑内培养技术）在20世纪80年代以前曾广泛应用于人狂犬病脑组织灭活疫苗的生产，如Semple、Fermi和Hempt疫苗等。但是，随着细胞疫苗的发展和神经组织疫
5、苗的使用安全问题，该技术已不再常用。1.2 禽胚胎培养技术710鸭胚培养技术过去主要用于人用狂犬病疫苗的生产，目前在实验室使用较少。1955年，Peck等开始研制狂犬病鸭胚疫苗，该疫苗于1957年在美国上市，到1973年已成为美国主要的狂犬病疫苗，但是进入80年代后，在疫苗生产中人二倍体细胞（HDC）培养取代了鸭胚培养技术。在狂犬病病毒适应鸡胚培养的研究发现，连续传4050代时，获得的低胚传代株（Flury-LEP）对小鼠、大鼠和仓鼠进行脑内或肌肉接种时仍具有致病性，豚鼠脑内接种也可感染，但肌肉接种时则无致病力；家兔脑内和肌肉注射均不发病；犬肌肉接种也不发病。但是，病毒在传代176至182代时
6、（Flury-HEP）大部分毒力会丧失，此时将病毒脑内接种成年鼠、兔、犬时，均无致病性。因此，一般高代次的Flury-HEP推荐在牛和猫中使用，Flury-LEP仅用于犬。Kelev株鸡胚疫苗系经鸡胚传代6070次的病毒，该病毒对仓鼠、豚鼠和兔的脑内和肌肉的接种均不产生感染症状；以高浓度的病毒对犬进行肌肉接种，也不出现感染症状。Flury和Kelev株均适于在鸡胚中生长，过去一直用于犬狂犬病疫苗的生产，其中Flury株在世界范围内广泛使用。鸭胚和鸡胚的接种基本一致，选取培养7天的健康胚，将狂犬病病毒毒液接种到卵黄囊内，鸭胚培养1014d，鸡胚培养910d。2. 体外培养技术1913年，Nogu
7、chi和Levaditi首次将组织培养技术用于狂犬病病毒的研究。1930年，Stoel将狂犬病病毒在移植于兔血浆凝块中的鸡胚脑和心脏内培养了5代，病毒感染力没有丧失。Atanasieu等利用小鼠食管膜瘤细胞系（一种非神经细胞）培养了狂犬病病毒街毒株和固定毒株，首次在细胞培养系统中报道了类似于Negri小体的胞浆内包涵体。人用狂犬病细胞培养灭活疫苗的研究始于1964年,该项研究表明，人二倍体细胞株WI-38株可以作为狂犬病固定毒PM株的适应细胞，用于疫苗生产。1967年，Merieux研究所开始利用人二倍体体细胞进行疫苗研发。1974年，人二倍体细胞培养灭活疫苗在法国批准使用，1978年开始商业
8、化生产。2.1 原代细胞培养技术前苏联以狂犬病病毒Vnukovo-32株感染原代地鼠肾细胞（PHKC），经紫外灭活后制备狂犬病疫苗，我国则以原代地鼠肾细胞（PHKC）培养狂犬病固定毒北京株，经甲醛灭活制备狂犬疫苗，主要用于暴露后治疗，其年需求量也相当大。还有一些类似的疫苗是在原代胎牛肾细胞和犬肾细胞上培养并制备的。其中原代胎牛肾细胞（FBKC）培养疫苗的适应毒株是巴斯德固定株PV-31，于1984年在法国批准用于暴露后治疗，1987年以后不再生产。有报道显示，FBKC疫苗有很好的耐受性和免疫原性，抗体反应类似于HDC疫苗。原代犬肾细胞疫苗的适应株是狂犬病固定毒PM株，PM株对人二倍体细胞也适应
9、。不同动物（小鼠、仓鼠、猪、犬和猴）源性的原代肾细胞培养物和禽类胚胎成纤维细胞对狂犬病病毒的易感性，证实了这些细胞具有用于狂犬病疫苗生产的潜力。如1960年Fennie报道了第一个用原代仓鼠肾细胞制备狂犬病疫苗，经过修饰后，结合狂犬病病毒北京株，我国已经将其用于人狂犬病疫苗的生产。Vnukovo-32株也是以类似的方式在前苏联用于狂犬病疫苗生产的。此外，人用疫苗也有以牛肾细胞、犬肾细胞和鸡胚成纤维细胞生产的，后者采用的病毒株为Flury LEP C25。人用狂犬病原代仓鼠肾细胞成品疫苗有冻干和液体2种剂形，由原代仓鼠肾细胞培养的狂犬病病毒固定毒株经甲醛灭活后制备，是我国此前主要的人用狂犬病疫苗
10、品种。狂犬病固定毒北京株在适应原代仓鼠肾细胞（PHKC）培养后，用于疫苗生产。该毒株是1931年从中国北京1条死于狂犬病的犬脑内分离得到的。通过在兔脑内连续传代后得到固定毒株，到1980年为止主要用于Semple神经组织疫苗的生产。狂犬病病毒Vnukovo-32株是SAD株的衍生株，该毒株源于1935年从美国阿拉巴马州的一条犬中分离出的野毒（SAD），经鼠脑和PHKC交替传代传代35代，再在37下经PHKC连续传10代，达到第32代，完成该毒株在原代仓鼠肾细胞（PHKC）中的适应，即称为Vnukovo-32。适应的毒株，在32，PHKC上培养，以第33代178代毒建立基础种子库和工作种子库，6
11、0或冻干保存。2.2 传代细胞培养技术人二倍体细胞（Human diploid cell, HDC）疫苗是最早商品化的细胞培养疫苗，目前已在世界范围内得到广泛应用，并成为其他狂犬病细胞培养疫苗的参照标准。法国Marcy lEtoile的Merieux研究所和德国Marburg的 Behring研究所研制的人二倍体细胞疫苗均以人二倍体细胞MRC-5培养，经-丙内酯（BPL）灭活后制得。两者不同的是，Behring研究所生产的疫苗经梯度超速离心进行浓缩和纯化，而Merieux研究所系通过超滤实现疫苗的浓缩。人用纯化鸡胚细胞疫苗(PCEC)是以原代SPF鸡胚细胞培养制备的，该疫苗为冻干品，其制备过程
12、主要包括-丙内酯灭活后狂犬病病毒抗原的纯化和浓缩等。早期对组织培养的研究发现，经鸡胚细胞培养的低代狂犬病病毒Flury株(low egg passage Flury strain, Flury-LEP)更适于作为疫苗株使用。在此基础上，1973年以Flury-LEP株研制出兽用灭活疫苗。以此系统进行人用鸡胚细胞疫苗的生产，首先须将收获的狂犬病病毒经蔗糖密度梯度离心，达到浓缩、纯化的目的。改良后的抗体结合试验可以用于灭活后狂犬病病毒抗原成分的定量。20世纪80年代，建立了多种适用于纯化鸡胚细胞疫苗的实验室检测方法，并开始了在人的临床试验。恒河猴胎猴肺二倍体细胞（FRhMDC）疫苗是由美国的公共卫
13、生部的密歇根州生物制品研究所在20世纪70年代开发的。1979年开始在志愿者中进行临床试验， 1988由美国食品与药物管理局（FDA）批准用于暴露前后狂犬病防治。人用狂犬病犬肾细胞疫苗是利用犬肾细胞在微载体上培养的。疫苗的冻干品包括经-丙内酯灭活的狂犬病病毒固定毒株和用以吸附病毒的磷酸铝佐剂。建立了敏感的细胞系和细胞株以后，可以系统研究狂犬病病毒及病毒与宿主细胞的相互作用。迄今已有很多传代细胞系用于动物狂犬病疫苗的制备，如BHK-21、仓鼠肾成纤维细胞（Nil-2）和鸡胚相关细胞（CER）。但由于某些细胞系的异源特性和潜在致瘤性，目前只有猴肾细胞Vero用于人狂犬病疫苗的制备。人二倍体细胞（W
14、I-38）在1964年首次报道用于人狂犬病疫苗生产，此后，其他二倍体细胞如人胚肺细胞（HEL）、人肺细胞（MRC-5）和恒河猴二倍体细胞系也用于人狂犬病疫苗生产。除了上面提到的细胞以外，狂犬病病毒还可在胚胎鸡肌管、鼠的巨噬细胞、大鼠感觉神经系统、大鼠垂体肿瘤细胞、黑山羊和豚鼠肾细胞、胎儿蝙蝠细胞、人滑液（McCoy）细胞、日本鹌鹑胚胎细胞和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）中复制。病毒接种昆虫细胞也能检测到病毒特异性抗原，但其水平明显低于其他细胞。人和小鼠源的成神经细胞瘤细胞已广泛用于狂犬病病毒研究，尤其是鼠成神经细胞瘤细胞（NA-C1300，为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷细胞株），显微镜下观察，
15、该细胞与人的神经元大致相同，细微结构都有神经元样形态，在微管蛋白、神经递质合成酶和可兴奋细胞膜上也有很多共同特征。狂犬病病毒固定毒株HEP Flury和LEP Flury可以在原代鸡胚细胞中培养，经-丙内酯（BPL）灭活后制备疫苗。20世纪60年代，Kondo等研制出了纯化的鸡胚细胞培养疫苗（PCEC），1980年批准使用。此后，很多国家引入了纯化鸡胚细胞培养疫苗用于暴露后治疗，特别是一些东南亚国家。德国Behring研究所也研制了一种类似的疫苗。一项935名受试者接种4247剂纯化鸡胚细胞疫苗的临床试验表明，与人二倍体细胞苗相比，纯化鸡胚细胞培养疫苗可诱导产生更高的抗体滴度。在欧洲，印度次大陆以及东南亚地区（泰国）均有大量此种疫苗生产并应用于暴露后治疗。接种病毒的组织培养细胞可用常规的单层或旋转培养法培养，悬浮培养也已成功。培养液的最适pH为7.47.6，适宜温度范围为3040，但低温培养(32)尤为适宜。3. 细胞发酵和生物反应器技术前一节介绍了狂犬病人二倍体细胞培养疫苗
