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1、评述与进展 磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展 柏兆方 王红霞 * (国家生物医学分析中心, 北京 100850) 摘 要 蛋白质的磷酸化是一种可逆性的翻译后修饰, 在细胞的增值、 分化、 信号转导以及转录与翻译调控、 蛋白质复合体的形成、 蛋白质降解等方面发挥着极为重要的作用。因此磷酸化蛋白的鉴定成为翻译后修饰研 究的重要内容。但由于磷酸化蛋白的丰度较低, 难以用质谱直接检测。为了解决这个问题, 改善质谱对磷酸 肽的信号响应, 需要对磷酸化蛋白质或磷酸肽进行富集。本文系统地介绍了磷酸化蛋白组学研究中应用较 为广泛和最新建立的各种分离富集方法的原理、 特点、 应用研究进展, 包括抗体富集
2、法、 激酶特异富集法、 亲和 富集法、 化学修饰法、 多种色谱分离富集方法以及 MALDI靶盘富集法。 关键词 磷酸化蛋白质组, 分离富集方法, 评述 2008211209收稿; 2008212210接受 本文系/ 十一五0国家科技支撑计划 (No . 2006BAF07B01)资助项目 *E2 mai: l whx2009 yahoo . cn 1 引 言 磷酸化是蛋白质翻译后修饰最为重要的形式。据统计, 哺乳动物细胞内的蛋白质有 1/3以上可以 被磷酸化。真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为酪氨酸、 丝氨酸和苏氨酸 1。其中, 磷酸化丝 氨酸最多, 磷酸化苏氨酸次之, 而磷酸化酪氨酸最
3、少, 三者的比例是 1800B 200B1 。最新实验鉴定到三者 在真核细胞的百分比为 86 . 4 % 、 11 . 8 %和 1 . 8 % 2。磷酸化蛋白在细胞信号转导、 细胞的分化、 增值、 周 期调控、 新陈代谢、 转录和翻译、 蛋白降解和细胞生存等 3方面发挥着重要的作用。 磷酸化蛋白在细胞生命活动中的重要作用, 使其成为蛋白质组学研究的热点。但是磷酸化蛋白自 身的一些特点, 使得磷酸化蛋白质分析仍是一件很具挑战性的工作。首先, 磷酸化蛋白质含量很低, 在 特定刺激下仅有少部分蛋白发生磷酸化; 其次, 磷酸化的可变性, 使得不同条件下蛋白存在不同的磷酸 化形式; 再次, 现有的分析
4、方法缺乏对磷酸化位点的动态分析, 使得部分位点难以鉴定。最后, 磷酸酶的 存在使得在样品制备过程产生脱磷酸化现象。因此对磷酸化蛋白或者磷酸化肽段进行富集, 提高磷酸 肽的相对含量, 成为磷酸化蛋白组学研究中的重要内容。 传统分析蛋白质磷酸化的方法是用放射性同位素 32P标记到磷酸化的蛋白质上, 带有放射信号的蛋 白质可以通过蛋白质的分离, 如二维凝胶或 HPLC分离及 Ed man测序等方法, 鉴定磷酸化氨基酸类型 及位点 4 , 5。这种方法除了具有放射性实验的缺点以外, 实验比较耗时并且不能进行高通量的磷酸化 蛋白组学分析。近年来, 一些富集方法不断改进及涌现, 如抗体法、 固相金属离子亲
5、和色谱 ( I mmobi2 lizedmetal ion affinity chro matography , I MAC)、 金属氧化物 /氢氧化物亲和色谱 (Metal oxide/hydroxide affinity chro matography , MOAC)、 离子交换和等电聚焦、 B2 消除 2 M ichael加成反应等。目前各种富集方法 与质谱 (Mass spectro metry , MS) 技术的结合已成为研究蛋白质磷酸化的主要工具, 逐渐取代了传统的 磷酸化蛋白质分析方法。本文综述了近年来用于分离富集磷酸化蛋白和肽段的各种方法。 2 磷酸化蛋白分离富集方法 2 .
6、1 抗体富集法 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀, 从复 杂混合物中免疫沉淀目标蛋白质。已经有商品化的抗酪氨酸、 丝氨酸和苏氨酸磷酸盐抗体, 其中抗酪氨 第 37卷 2009年 9月 分析化学 ( FENXIHUAXUE) 评述与进展 Chinese JournalofAnalyticalChemistry 第 9期 1382 1389 酸磷酸盐抗体最为常用。免疫沉淀技术对抗体的要求更高, 抗磷酸酪氨酸抗体具有较好的亲和性可以 进行免疫沉淀实验。磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗原决定簇较小, 抗原抗体结合位点有空间障碍, 抗体 的结合力较差 6, 所以多年
7、来一直没有用于免疫沉淀分析。 Schumacher等 7利用两种不同的磷酸化酪氨酸抗体对肿瘤细胞系 SU2 DHL21裂解液分别经免疫沉 淀和免疫亲和层析富集磷酸化酪氨酸蛋白, 经质谱鉴定表明双抗免疫沉淀法可鉴定到更多的磷酸化蛋 白。Pandey等 8用抗磷酸化酪氨酸抗体免疫沉淀表皮生长因子 (EGF)刺激后的 H eLa细胞总蛋白质和 未刺激的 H eLa细胞总蛋白质, 通过 MS分析共鉴定出 7个已知的 EGF 激酶底物和 1个新的 EGF激酶 底物 Vav22 。Chong等 9也利用磷酸化酪氨酸抗体富集鉴定到 3个新的 EGF信号通路下游的靶蛋白, 并且通过该方法还可对蛋白质相互作用进
8、行研究。Gronborg等 10对多种商品化的抗磷酸丝氨酸 /苏氨 酸抗体的免疫沉淀性能进行了评价, 发现有 3个抗磷酸丝氨酸 /苏氨酸抗体可应用于免疫沉淀, 并成功 富集了磷酸酶抑制剂 Calyculin A诱导的 HeLa细胞磷酸化蛋白质。 2 . 2 激酶特异富集法 很多激酶不仅以相互协同的形式动态调控着信号通路, 而且还通过特异位点磷酸化来调控自身以 及不同激酶间的功能活性 11。但是由于激酶相对于其底物来说丰度更低, 因此在已有的磷酸化蛋白质 组学研究中对于激酶的磷酸化位点的研究尤为不足。免疫沉淀技术可以用于大规模的磷酸化蛋白质组 学研究, 磷酸化酪氨酸蛋白特异性抗体可以用于磷酸化激
9、酶的富集, 但是这些方法不能对激酶进行特异 性富集。为了对激酶磷酸化状态进行研究, 利用小分子的磷酸激酶抑制剂对其进行特异亲和层析成为 激酶磷酸化蛋白质组学研究的重要方法 12。另外激酶抑制剂与激酶结合蛋白共同富集显著提高了激 酶磷酸化蛋白质组学鉴定水平 13。 Godl等14 首先利用激酶特异富集法对 p38 激酶的抑制剂 SB 203580的作用底物进行研究, 他们利用螯合反应固定了 SB 203580的亲和柱富集鉴定的几个未知的激 酶底物, 并且研究认为:SB 203580对 RICK Rip2like interacting caspase2like apoptosis2regulat
10、ory protein (CLARP) kinase/Rip2/CARDI AK抑制作用更加灵敏。Daub等 15 利用激酶抑制剂亲和层析法对周期 阻滞到 S和 M期的 H eLa S3细胞系进行了定性及定量研究, 他们采用同位素标记的固定培养技术对细 胞进行培养。细胞裂解后利用 5种不同的激酶抑制剂螯合的 3个层析柱进行连续富集, 洗脱液混合后进 行磷酸化蛋白组学分析, 对 219个 S和 M期的磷酸化激酶进行了定量分析, 同时鉴定了 1000多个激酶上 的磷酸化位点, 并且鉴定到新的与有丝分裂相关的激酶, 在细胞信号通路研究上显示了独特的优势。 2 . 3 亲和富集法 目前, 一些商品化的
11、试剂盒主要采用磷酸化蛋白亲和富集法。利用磷酸基团与一些金属离子或金 属氧化物等的亲和作用, 实现对磷酸化蛋白的富集。ProteoExtract Phosphoproteion Capture K it(MERCK) 是一种亲和富集试剂盒, 试剂盒提供了磷酸化蛋白富集所需的所有试剂, 每个试剂盒可用于处理 25 g 哺乳动物组织或 1 10 9 个培养细胞。现在运用比较多的磷酸化蛋白富集试剂盒主要是 Qiagen公司的 PhosphoProtein PurificationK it 。PhosphoProtein Purification Kit利用亲和层析技术来分离细胞裂解液中的 磷酸化与非磷
12、酸化蛋白, 可得到保持有生物活性的蛋白。 Li等 16通过 PhosphoProtein PurificationK it对代谢标记和 SDF2 刺激的 Jurket细胞裂解液进行富集, 后经 SDS2 PAGE分离切取 PTEN所在位置附近的 5条带进行质谱鉴定, 结果鉴定到 PTEN蛋白上 2个磷 酸化位点 S和 T, 并且经生物学实验证明该磷酸化位点对 PTEN的功能起着重要的作用。Klemm等 17 利用该方法对永生化小鼠脑毛细血管内皮细胞株 ( I mmortalized rat brain capillary endothelial cells)的磷 酸化蛋白进行富集, 在经 SD
13、S2 PAGE电泳后, 提取肽段进一步利用 T i O2富集磷酸化肽段也显示出独特 的优势。Chew等 18在对 Drebrin E2在胃粘膜上皮细胞的表达研究中, 通过该试剂盒富集后进行质谱 鉴定了 Drebrin E2的磷酸化位点并对其生物学活性进行了深入研究。 除此之外, 还有 ProteoEnrich TM ATP2 Binders TM试剂盒 ( Calbiochem)。该试剂盒仅用于蛋白激酶和其 它 ATP结合蛋白 (ATP2binding proteins , ABPs)的抽提富集。 1383 第 9期柏兆方等:磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展 3 磷酸化肽段的分离富集方
14、法 3 . 1 化学修饰法 用亲和试剂取代磷酸化肽段上的磷酸集团, 再用亲和提取的方法从混合肽段中分离磷酸化肽段, 是 一种有效的化学修饰法。磷酸化的丝氨酸和苏氨酸在碱性条件下发生 B2 消除反应成为化学修饰富集 的重要理论基础 19 , 20。B2 消除磷酸基后产生的双键成为 M ichael加成反应的受体21。研究表明, 亲核 的巯基可在 B2 消除后的丝氨酸和苏氨酸残基处共价结合完成 M ichael加成反应, 在通过巯基另一端相 连的生物素经液相色谱亲和层析, 完成对磷酸化蛋白的富集。但是该方法存在灵敏度低、 低丰度蛋白易 丢失以及小分子磷酸化蛋白难以分析等不足。 Tseng等 22利
15、用上述方法的基本原理, 改用 Ba(OH ) 2碱性溶液作为 B2 消除的反应条件, 同时对 M ichael加成供体进行了整合, 利用巯基和碘乙酰胺直接共价相连; 碘乙酰胺另一端连接到树脂上, 通 过固相的 Michael加成直接捕获磷酸化肽段到树脂上。非磷酸化肽段及其碎片离子经洗脱除去, 磷酸 化肽段则形成共价标签接合于树脂上。这样可以在剧烈的条件下进行洗脱, 再经酸裂解释放肽段。利 用该方法研究认为 CDK5催化 MAP2和 TAM在同一结构域发生磷酸化, 还可从鼠脑样品中高特异性的 分离磷酸化蛋白。 与其它方法相比, 该方法具有许多优点: 磷酸化位点的标记和肽段的富集在单独的固相树脂上
16、即可 完成, 减少了样品的丢失, 有利于低丰度的富集; 碘乙酰胺标签的质量小于生物素标签的质量 23, 这样 扩大了肽段富集和分析的范围; 同时, 碘乙酰胺标签与肽段共价相连, 减少了质谱分析中的中性丢失; 研究证明, 在 B2 消除中引入 Ba(OH )2可有效降低糖肽的消除反应 24, 进一步较少了副反应, 提高了分 析的特异性。 该方法的不足之处是: 它仅能用于对磷酸化苏氨酸和磷酸丝氨酸的分析和鉴定, 而磷酸化酪氨酸则 不发生消除反应。另一种是通过化学反应在磷酸基团上连接 1个半胱胺基团 (Cystea m ine), 修饰的磷 酸肽用固相化的碘乙酰凝胶亲和提取 25, 这种方法可实现各种磷酸氨基酸的取代, , 但是肽 N端必须首 先用 tBoc(Tert2butyloxycarbonyl) 保护; C端则进行酰胺化保护, 以避免杂反应产生。化学修饰法对多 磷酸化的肽段的分离效果不佳, 并且存在副反应 26。 3 . 2 色谱分离富集法 3 . 2 . 1 I
