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1、 放射生物学实验报告 1 小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告 一、实验目的 1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理 2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础 二、实验材料 1.淋巴细胞分离液 2.EDTA 抗凝剂 常用 EDTA 的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物， 而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固 3.PBS 缓冲液 PBS 缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用 4.戊巴比妥钠溶液 作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持 3 6 小时， 显效较快。 用作催眠和麻醉前给药， 亦可用于治疗癫痫和破伤风
2、的痉挛。 5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul 的枪以及 相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP 管（5ml，10ml） 三、实验原理 外周血中各种细胞的密度不同。 密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比 重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的 血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。 第一层为血浆层。 第二层为环状乳白色淋巴细胞层。 第三层为透明分离液层。 第四层为红细胞层 放射生物学实验报告 2 图图 1 小鼠外周血小鼠外周血离心离心前后示意图前后示意图 四、实验步骤 1.给小鼠注射适量
3、的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉 2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入 100ulEDTA 抗凝剂的 5mlEP 管中，取足 1ml 新鲜血液 3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入 1mlPBS 缓冲液的 5ml 的 EP 管中稀释(血液 与 PBS 的比率为 1:1) 4.用滴管将稀释后的 1ml 新鲜血液沿试管壁缓缓 （一定要慢）加到含有 2ml 淋巴 细胞分离液(事先要恢复到室温)的 10mlEP 管中（稀释血液：分离液=1:1） ，沿管 壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面 5.经水平式离心机离心（1500r/min）15 分钟，小心取出试管 6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞， 用 PBS 溶液洗涤两次，每次离 心 1800r/min，离心 10min 7.弃上清液，加入 4mlPBS 待用 放射生物学实验报告 3 图图 2 第一次离心后图片第一次离心后图片 五、注意事项 1.EDTA 和淋巴细胞分离液使用前应预温至 22 2.在淋巴细胞分离过程中，应控制室温在 2225，过低或过高应延长或缩短离 心时间 六、实验思考 第一次分离后淋巴细胞层存在红细胞， 应该是抗凝剂储存时间久导致血液抗 凝补充分的缘故。
