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1、1 DIG Northern Starter Kit DIG Northern 标记及杂交检测试剂盒标记及杂交检测试剂盒 说明书版本：Version 8.0 （2010 年 8 月） 利用体外转录法进行地高辛标记的 RNA 探针合成反应，采用酶联免疫方法及即用型化学发 光底物 CDP-Star 进行杂交分子的检测。 利用本试剂盒可进行 10 次标记反应，和 10 次杂交检测反应（1010cm2杂交膜） 。 产品目录号：12 039 672 910 试剂盒于-15 -25保存 2 1. 概况概况 1.1 说明书内容说明书内容 1. 概况概况 2 1.1 说明书内容2 1.2 试剂盒组成3 2.
2、介绍介绍 5 2.1 产品概述5 3. 实验步骤和需要的材料实验步骤和需要的材料7 3.1 实验开始前准备7 3.2 实验流程7 3.3 DNA 模板制备7 3.4 DIG-RNA 标记9 3.5 定量标记反应效率10 3.6 适用于 DIG Northern bolts 的凝胶系统12 3.7 RNA 转膜和固定13 3.8 杂交 14 3.9 免疫检测15 3.10 探针洗脱和重探17 4 附录附录 18 4.1 疑难问题解决18 4.2 参考文献19 3 1.2 试剂盒组成试剂盒组成 管管/瓶号瓶号 标签标签 成分及成分及功能功能 1a Labeling Mix 40l，即用型 5标记混
3、合物，含浓度优化的未标记核苷酸和 DIG-11-UTP 用于线性化 DNA 模板的高效体外转录 澄清的粘性溶液 1b Transcription Buffer 40l，用于线性化 DNA 模板的高效体外转录 5 转录缓冲液 澄清溶液 2 SP6 RNA Polymerase 20l，20U/l 从 DNA 模板合成 RNA 3 T7 RNA Polymerase 20l，20U/l 从 DNA 模板合成 RNA 4 T3 RNA Polymerase 20l，20U/l 1 从 DNA 模板合成 RNA 5 Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments 60l 750U
4、/ml，Fab 片段，羊源，结合了碱性磷酸酶 澄清溶液 6 DNase I, RNase free 20l，10U/l 用于转录反应后将 DNA 模板降解 7 CDP-Star, ready-to-use 20ml 碱性磷酸酶化学发光底物 8 Actin RNA probe, DIG- labeled 反义链探针，588bp 10 ng/l 在 DIG 标记 RNA 探针的定量实验中作为标准物 质，以及杂交过程的质控样本 9 DIG Easy Hyb Granules 可制备成 2 瓶 100ml 溶液 杂交液 10 Blocking solution 2 100ml，用于化学发光检测过程 1
5、0储液, 黄色，粘性溶液 杂交反应所需的仪器和其他反应试剂杂交反应所需的仪器和其他反应试剂 请根据您的实验操作流程准备杂交反应所需的仪器和其他试剂， 参见下表， 请注意所有试剂 应使用 DMPC 或 DEPC 处理的水配置： （说明书）杂交操作步骤说明书）杂交操作步骤 设备设备 试剂试剂 3.3 DNA 模板制备 3.3.1 标准制备方法 或 High Pure Plasmid Isolation Kit * 酚/氯仿 4 3.3.2 RT-PCR/PCR 制备 PCR 反应仪 Expand High Fidelity PCR System * 引物（正义链，反义链） dNTPs 各 10mM
6、 3.4 DIG-RNA 标记 水浴设备 冰/水 灭菌的双蒸水 0.2M EDTA（pH8.0)，灭菌 3.5 定量标记反应效率 带正电荷的尼龙膜* 紫外交联设备 烘箱（120或 80） RNA 稀释缓冲液 DIG Wash and Block Buffer Set* 或 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 3.6 适用于 DIG Northern bolts 的凝胶系统 3.6.1 含甲醛凝胶 电泳设备 水浴/温浴设备, 65 冰 10 MOPS, pH7.0 （含 NaOH） 上样缓冲液 凝胶溶液 电泳缓冲液 3.7 RNA 转膜和固定 带正电荷的尼龙膜* Whatmann 3MM 纸
7、紫外交联设备 烘箱（120或 80） 根据转膜方法的不同 20 SSC 或 2 SSC 3.8 杂交 带正电荷的尼龙膜* 冰/水 水浴，带振荡功能 或杂交炉 杂交袋* 或耐热的封 闭塑料袋，或杂交滚筒 注意注意：使用 DIG Easy Hyb 作为杂交缓冲液 时，不可使用敞开容器 洗涤步骤 2 SSC, 0.1% SDS 0.1 SSC, 0.1% SDS 3.9 免疫检测 与杂交膜大小相适的 容器 杂交袋* 或 曝光折叠夹 DIG Wash and Block Buffer Set* 或 洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液 3.10 探针洗脱和重探 大托盘 水浴设备 杂交袋* 2 SSC
8、洗脱缓冲液 灭菌的双蒸水 带*的试剂为罗氏应用科学部提供的试剂。 5 2. 介绍介绍 2.1 产品概述产品概述 反应原理反应原理 DIG Northern 标记及杂交检测试剂盒采用体外转录法，以地高辛（DIG，一种甾类半抗原） 标记的 UTP 为底物，进行 RNA 探针的标记合成，所获得的单链 RNA 探针用于后续的杂交 反应，带有地高辛分子的杂交子通过酶联免疫反应和 CDP-Star 底物进行化学发光检测。 步骤步骤 描述描述 RNA 标记标记 利用体外转录法和地高辛标记的 DIG-11-UTP 对 DNA 模板进行体外 转录标记，获得 DIG 标记的 RNA 探针。试剂盒中的标记反应液为浓
9、 度优化的 DIG-UTP 和 dNTPs 的混合物， 结合特殊优化的转录缓冲液， 合适的 RNA 聚合酶，及线性化 DNA 模板进行高效标记反应。 杂交杂交 采用标准反应方法，DIG 标记的 RNA 探针可以与固定在膜上的核酸 进行杂交。 免疫检测免疫检测 杂交子中的 DIG 通过 anti-DIG-AP 抗体进行免疫检测，并通过化学发 光底物 CDP-Star 进行结果显示。CDP-Star 在碱性磷酸酶 AP 的作用 下产生激发光，其最大吸收波长在 465nm（图 1） ，激发光可用适合 的图像系统或者 X 光片进行记录。胶片的曝光时间只需 530 分钟。 应用应用 尼龙膜上的 Nort
10、hern blots 杂交反应 样本样本 线性化质粒，质粒上含相应的 RNA 聚合酶启动子序列（SP6，T3，T7） 注意：注意：质粒上待转录的目标片段长度应在 200-1000 bp。为避免 RNase 污染，DNA 模板须 经酚抽提处理。 特殊制备的 PCR 产品（见本说明书 3.3.2） 6 分析时间分析时间 步骤步骤 反应时间反应时间 RNA 标记 1h 20min 杂交 6h过夜反应 免疫检测 1h 40min 化学发光信号检测 530min 试剂盒反应次数试剂盒反应次数 本试剂盒包含 对 1g DNA 进行 10 次标记反应，每次反应产出约 20g 标记的 RNA 探针 10 次杂
11、交检测反应（10 10cm2杂交膜） 试剂盒保存试剂盒保存/稳定性稳定性 未开启的试剂盒可在-15 -25下稳定保存至产品有效期限，具体日期请见试剂标签说明。 试剂盒开启后，不同的试剂盒组分请在下表所列的条件下保存： 试剂盒组分试剂盒组分 保存保存 Labeling Mix（管号 1a）和 Transcription Buffer（管号 1b） 在-15 -25条件下可稳定保存，避免反复冻融。 为避免反应液被污染，建议将试剂分装为 2-3 份。 RNA polymerases（管号 2-4） 在-15 -25条件下可稳定保存 Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments
12、 （管号 5） 2 8，可稳定保存 注意：注意：勿冻存! CDP-Star, ready-to-use（管号 7） 2 8可稳定保存，避光保存 DIG Easy Hyb Granules （瓶号 9） 15 25下稳定保存 开启并制成溶液后，在保证无菌的情况下可稳定保 存 1 月 Blocking solution,10 （瓶号 10） 2 8可稳定保存 注意：注意：建议将 10 储液分装，于-15 -25条件下保 存，每次实验时，新鲜配制工作液 灵敏度和特异性灵敏度和特异性 在 0.1g 总 RNA 中，可检出极低浓度 mRNAs。 优势优势 实验实验优势优势 试剂盒特性试剂盒特性 准确、快
13、速 该试剂盒的所有组分经过优化和应用验证， 减少手工步骤的同时，增 加标记 RNA 探针的得率和标记反应重复性 灵敏度高 在人和植物等样本 RNA 中可检出极低浓度 mRNA 节省试验时间 将 DIG 标记的 RNA 探针溶于乙醇溶液，可在-15 -25条件下稳定 保存至少一年。建议将制备的探针分装保存，避免反复冻融。 7 3. 实验步骤和需要的材料实验步骤和需要的材料 3.1 实验开始前准备实验开始前准备 实验操作建议实验操作建议 建议建议 操作操作指导指导 请在洁净条件下和无 RNase 污染条件下进行实验 所有溶液用经过 DMPC 或 DEPC 处理过的水制备 溶液均经高压灭菌处理 将 Tween 20 加入到预先灭菌的溶液 使用洁净的孵育容器 所有孵育容器在使用前经 RNase-ZAP（Sigma R-2020） 严格洗涤和漂洗，玻璃器皿使用前 200烘烤 8 小时 膜操作要求 戴无粉手套进行操作 使用洁净的镊子，仅对膜的边缘进行操作 3.2 实验实验流程流程 3.3 DNA 模板制备 3.4 DIG-RNA 标记 3.5 定量标记反应效率 3.6 适用于 DIG Northern bolts 的凝胶系统 3.7 RNA 转膜和固定 3.8 杂交 3.9 免疫检测 3.10 探针洗脱和重探 3.3 DNA 模板制备模板制备
