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1、反向遗传操作在牛病毒性腹泻病毒研究上的应用翁晓刚，朱要宏，王九峰（中国农业大学动物医学院，北京 100193）摘要：反向遗传操作系统的建立为 RNA 病毒的研究提供了一个强大的工具。该技术从上世纪 90 年代开始被应用于牛病毒性腹泻病毒研究工作，此后该病毒的分子生物学研究取得了长足的进展。本文综述了反向遗传操作在牛病毒性腹泻病毒上的建立过程以及该技术在病毒生物型形成、病毒复制和病毒蛋白功能等研究上的应用及进展。关键词：牛病毒性腹泻病毒；反向遗传；生物型；病毒复制；病毒蛋白Application of Reverse Genetic on Bovine Viral Diarrhea Virus
2、ResearchWENG Xiao-gang, WANG Jiu-feng(College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193)Abstract: The establishment of reverse genetic system provided a powerful tool to RNA virus research. The molecular biology on bovine viral diarrhea virus has achieved significant impr
3、ovements after the application of reverse genetic in 1990s. This article reviewed the history of the application reverse genetic technology on this virus, and the recent progress on the virus biotypes transformation, virus replication, and functions of viral proteins.Key words: BVDV; reverse genetic
4、; biotypes; virus replication; viral proteins0 引言牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV ）是影响畜牧业发展的重要病原。BVDV 可感染牛、羊、鹿以及猪等动物，目前广泛流行并呈全球性分布 1-6。它可引起动物产生多种临床症状，从轻度腹泻、呼吸道疾病到流产，甚至粘膜病 7。BVDV 能够导致宿主的免疫耐受并形成持续性感染（PI ） ，这也是该病毒能够持续存在并广泛流行的重要因素 8-9。牛病毒性腹泻病毒属于有囊膜的小型 RNA 病毒，是黄病毒科瘟病毒属的典型成员。BVDV 基因组全长 12.3-12.5k
5、b，包含一个大的开放阅读框（ORF）， 编码大约 3900 个氨基酸。由于该病毒在基因复制过程中不涉及 DNA 的合成，其基因组即为翻译蛋白的 mRNA，因此我们无法直接对其进行研究。为了实现在基因水平的操作，需根据病毒RNA 序列得到 cDNA（反转录或人工合成） ，并在此基础上进行改造，然后将 cDNA 直接导入受体细胞或体外转录得到感染性 RNA，再导入细胞而产生有活力的病毒。由于该过程能够由无生命活性的 DNA序列得到有活性的病毒，因此又称为“病毒拯救” 。广义上说，凡是涉及到从基因水平研究遗传性状的过程都可以称为反向遗传。但是狭义上，RNA 病毒的反向遗传操作是指以构建感染性克隆为基
6、础，并在此基础上对病毒进行改造并“拯救” ，最后通过研究改造病毒来揭示目的基因或蛋白的功能。反向遗传操作已经成为了研究 BVDV 的有力工具，其在病毒复制、基因结构和功能、生物型的形成机制及病毒蛋白的功能等方面的研究发挥了重要的作用。1 反向遗传操作在 BVDV上的建立1978年，Taniguchi第一次获得了基因组长度为4.5kb的Q噬菌体感染性克隆并成功完成了首例RNA病毒的拯救 10。此后，科学家相继在脊髓灰质炎病毒、植物类病毒、流感病毒和呼肠孤病毒等其它RNA病毒上应用了该技术 11-12。在BVDV 所在的黄病J毒科中，目前已有多株病毒建立起了反向遗传操作系统。其中包括在1997年由
7、Kolykhalov和Yanagi分别构建成功的HCV感染性克隆 13-14。BVDV 感染性克隆的成功构建离不开前人在其它正链RNA病毒上的建设性工作，特别是该技术在猪瘟病毒上的大量研究应用。1996年，Moormann等第一次用CSFV C株作为参考母本进行分段克隆，最后将片段连接于由低拷贝质粒pOK12改造而来的载体上，随后进行体外转录，最后成功转染并在此基础上得到了多株改造病毒。这是感染性克隆在瘟病毒属上的首次成功构建 15。不久后，Ruggli和 Meyers等也使用类似方法得到 CSFV的改造病毒并得到缺陷干扰粒子 16-17。同年，Meyers 等基于猪瘟病毒的研究基础，第一次成
8、功拯救出BVDV CP7毒株。作者参考了三株CSFV毒株的感染性克隆构建策略和方法，并在此基础上完成了对BVDV 的拯救。作者使用了pACYC177 低拷贝质粒作为全长 cDNA的载体，构建出包含T7启动子的全长cDNA后于体外完成转录，然后将MDBK作为受体细胞，转染后利用了蚀斑实验、Northern blot和RT-PCR检测拯救病毒。然而由于当时技术水平的限制，他们获得的拯救病毒并不是源于CP7 的准确基因组，主要原因是没有获得病毒基因组两端的准确序列。他们使用了其它毒株的UTR克隆片段与CP7的部分片段连接，在此基础上构建了感染性克隆 18。随后，Rice等人为了研究病毒NS2区碱基的
9、插入与致细胞病变的关系而尝试构建该病毒的感染性克隆，他们选择了将NADL株作为构建母本。起初，研究人员在构建过程中选用pBR322改造质粒作为载体来连接基因组，但是没有成功。随后选择了在CSFV上应用过的pANCR1180，但是又发现将质粒转染入细菌后后者生长不良，其需要较长时间才能形成菌落。因此又选用了许多菌种进行对比，最后发现E.coli SURE较为理想。全长 cDNA 的准确构建是病毒反向遗传操作的关键步骤。由于传统的分段克隆首先需要依据碱基序列选择不同的酶切位点，然后使用载体分别克隆目的片段并将各个片段依次连接到最终的转录载体上，各个步骤都涉及到许多重复的常规操作，因此工作量巨大。然
10、而，随着反向遗传技术在 RNA 病毒中应用的扩展和深入，对于 BVDV 的拯救，从全长 cDNA 的构建方式到载体的选择都出现了新的方法和多种选择。首先，由于普通克隆质粒在插入长片段后其保真性会显著降低，因此在构建 RNA 病毒的感染性克隆时多选用拷贝数很低的质粒载体，比如细菌人工染色体（BAC） 。有报道称，单拷贝的 BAC 载体能够携带接近 30kb 的基因片段 19。Fan 等人在细菌人工染色体 pBeloBACII 上插入克隆接头序列，然后成功将BVDV SD1 全基因组连入该载体上，最后利用该载体首次成功拯救出 SD1 毒株 20。随后 Mischkale 等在前人的基础上又成功构建
11、了 BVDV2 型毒株 strain 890 的感染性克隆 21。另一方面， 在感染性克隆的构建方法中，除了多片段克隆连接的传统方法外，还出现了长片段 PT-PCR 的方法。Rasmussen 等首次应用长片段克隆的方法得到 BDV 的 cDNA 全长复制子，然后又利用该方法成功获得 BVDV CP7 的感染性克隆 22。2 反向遗传操作在 BVDV研究上的应用2.1 生物型的转变依据对培养的宿主细胞是否产生病变效应可将BVDV 分为致细胞病变(cp)和非致细胞病变 (ncp)两种生物型。病毒在宿主体内由 ncp 型向 cp 型的转变是粘膜病（MD）发生的重要原因。探究 BVDV 生物型转变的
12、分子机制也一直是学者们的研究热点。反向遗传系统在 BVDV 上的首次建立就显示它在该研究领域的强大力量，Meyers 等首次建立该技术平台后研究了序列的插入和缺失对病毒生物型的影响，研究发现 CP 7 毒株的出现是 ncp 毒株基因重组的结果，并且第一次通过 NS2-3 部分片段的重组实现 ncp BVDV向 cp BVDV 的转变。作者证实 NS2 编码区的 27 个碱基的重复序列与 cp 效应密切相关，在 cp 毒株上替换含该序列的片度后能实现向 ncp 毒株的转变。最后作者又构造了嵌合体 cp BVDV 以验证 CP7 的基因重组是致细胞病变的原因。随后，Mendez 等在 NADL毒株
13、上利用反向遗传技术研究阐明了该毒株的非结构蛋白 NS2 编码区 270 个碱基的插入与其生物型之间的关系。研究结果发现感染性克隆在缺失该片段后得到的病毒立即丧失了致细胞病变效应，随后的实验证明此现象是源于病毒 RNA 的合成量减少 23。此前对BVDV 生物型转化的研究中，大家普遍认为基因重复、基因重排、片段缺失和宿主细胞基因片段插入是形成 cp 毒株的主要原因，然而 Kummerer 等的研究表明 NS2 蛋白编码区的点突变也是 BVDV 生物型转变的重要因素。Kummerer 等构建了 cp 型毒株Oregon 株的感染性克隆，在此基础上拯救出多株JNS2 区域点突变病毒，最后证明个别碱基
14、的改变也能导致病毒生物型的转变 24。除了 NS2-3 编码区能够影响病毒致细胞病变效应，NS4B 非结构蛋白也与BVDV 的生物型转变相关。Lin 等在获得 NADL 株感染性克隆的基础上将其改造成为能够产生嘌呤霉素乙酰转移酶的双顺反子，然后利用该方法筛选出了几株ncp 毒株，发现这些病毒也能够产生 NS3 蛋白和病毒RNA，并且与母本相比其产生量无显著差异。测序结果显示这些 ncp 病毒的 NS3 基因序列无任何改变，进一步分析表明 NS4B 区的第 15 位氨基酸残基由 Y变成了 C 才是根本原因 25。此后，Becher 等又发现了 cp 型毒株向 ncp 型转变的例子，研究人员观察到
15、某些 cp BVDV 毒株在细胞中生活几代后会迅速转变为 ncp BVDV26-28。为了阐明这种现象的分子机制，他构建了 2 株致细胞病变毒株：CP442 与 CP552（先前的研究显示只有这两株病毒在传代后能够产生 ncp毒株），对其序列进行分析后发现这两株改造病毒都含有宿主细胞的 Ned88 序列，该外源序列位于 NS4A与 NS4B 之间。进一步的研究还表明该序列的插入是形成 cp 效应的先决条件，在此基础上大量传代后，能够分离出 ncp BVDV。除了基因结构外，温度也可能是影响 BVDV 生物型的一个因素。 Pankraz 等在此前的研究基础上构建了一株温度敏感型 BVDV 毒株T
16、S2.7。该毒株在低温时能够引起宿主细胞的病变效应，而当温度升高时（39.5）其 cp 效应显著降低，并且此时病毒的复制和 NS3 表达量并未受到影响，这是温度对该病毒生物型能够产生影响的首次报道 29。2.2 病毒复制病毒的复制主要包括 RNA 的复制以及病毒蛋白的翻译和组装过程。牛病毒性腹泻病毒 5UTR 和 3UTR 在病毒 RNA 的复制过程中起着非常重要的作用。与瘟病毒属其它成员以及丙肝病毒相似，BVDV 的5UTR 也含有核糖体结合位点（IRES）的功能区域30-32，该结构参与病毒蛋白的起始翻译过程。在HCV 上，研究人员已经预测出瘟病毒和丙肝病毒的5UTR IRES 含有两个功能茎环，名为 Ia 和 Ib33-34。先前的研究已表明瘟病毒属的各个成员其两个茎环结构特点和序列高度保守 35。而对于 BVDV 的 3UTR，整个区域含有三个茎环结构，由两个单链区将其分开。在反向遗传技术建立之前，由于不能在RN
