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1、体细胞胚胎发生及农杆菌介导转化摘要：通过直接和间接的手段（介导的愈伤组织）为Bixa orellana的建立，维护，再生，改造体细胞胚已经实现，Bixa orellana是一种热带植物，其种子生产市售食用红木色素，而食用红木色素主要构成apocarotenoid称作安必信。愈伤组织介导的方法被认为是短时间内生产大量细胞胚的最有效的方法。未成熟的合子胚接种在Murashige和斯库格（MS）培养基上，培养基中包含有0.44微莫的苄基腺嘌呤（BA）、0.054微莫-萘乙酸（NAA）、2.89微莫赤霉素（GA3）、0.02微莫三碘苯甲酸（TRIA）。在生长到16-18周的时候有最多28个体细胞肧产生
2、。愈伤组织通过下胚轴吸收MS培养基中的营养，培养基中加有4044UMBA，40UMAgNO3和0.011UMTRIA。体细胞胚在含有0.44-0.4UMBA，0.54-2.69NAA，4.96UM钙，0.21UM生物素，227.7UM一水半胱氨酸盐酸和108.6UM腺嘌呤硫酸盐。农杆菌GV3101含有PCAMBIA1305.2二元载体介导的稳定转化体。胚胎展示出了2.56%的转化率。由于体细胞胚在任何与商业化和科学性相关的多年生体系中都是非常有用的，基于这个体细胞胚的途径，对商业上重要的燃料高产的热带植物B奥雷利亚纳进行基因工程改造是有用的。关键词：农杆菌、红木素、再生、生根、三十烷醇缩略词：
3、BA：苄基腺嘌呤GA3：赤霉素IAA：生长素-3-吲哚乙酸MS：Murashige-Skoog培养基NAA：萘乙酸PGR：植物生长调节剂TIBA：2，3，5-三苯基甲酸TRIA：三十烷醇介绍体细胞胚胎对任何植物转化来说都是主要的工具，不管是农杆菌介导还是基因枪这两种主要的植物转化方法，因为最初的是通过基因工程试验来改造农作物基因的 。相似的，植物组织学上，体细胞胚扮演者一个比任何其它器官部分都重要的角色。红木色素主要是构成安必信和norbixin种子上的假种皮部分。(2n = 2x = 14)。他们也被称为含氧的类胡萝卜素。这两个主要着色成分红木色素的脂溶性diapocarotenoid90顺
4、安必信，一个norbixin的甲基酯，二元酸的水溶性90-norbixin顺。基于结构特征，他们被列为异戊二烯衍生物（哈日等，1994）。欧盟已批准作为食品添加剂43着色剂，被分配一个不同的E的数量每个着色剂，其中17个是人工合成的，剩下的都是自然或自然衍生化合物（道纳姆和柯林斯2000年）。红木色素的E-号码或EEC（欧洲经济共同体）数量E160b。体细胞胚胎发生的标准化有助于保持和增强乘法利益的精英克隆更高的生产率和经济效益，也为建立和实用工具转变为基因工程研究协议来调节生物合成途径（Kumar等，2006年，2007）。奥雷利亚纳在B，由于种子活力低（20）和贫困发芽（5），具有商业价值
5、（DSouza和沙龙2001），在体外研究。如2,4-D的一些植物生长调节剂，是众所周知的发挥重要作用，在众多的植物物种的体细胞胚的诱导和建立。诱导体细胞胚胎发生在少数几个物种，如咖啡树属（Giridhar等，2004），番木瓜（查亚和其他植物生长调节剂，如三十烷醇（TRIA）和2,3,4 - 三碘苯甲酸（TIBA）Bhattacharya 和 Khuspe2000年）。在这项研究中，其中一些植物生长调节剂诱导体细胞胚胎发生和红木再生的影响进行了研究。此外，体细胞胚胎用于发展中国家的红木农杆菌介导转化协议。材料和方法外植体的准备和体细胞胚胎的建立B.，奥雷利亚纳研究（Bixaceae）未成熟的
6、果实（50-60日龄）共收集2006年9月期间，从5岁的植物，在植物细胞生物技术系中央食品技术研究所（CFTRI），迈索尔，印度。收集水果，70的乙醇浸泡5分钟，其余所有程序使用空气层流无菌条件下进行的。发展中国家的种子取出未成熟的水果，70的乙醇冲洗1分钟，洗净，用无菌蒸馏水和干燥印迹两次。这些未成熟合子胚全部或胚胎的茎被用来作为单独作为主要的直接体细胞胚胎发生的诱导外植体。初级细胞胚的诱导外植体两种类型，即，未成熟合子胚和幼胚柄（缺乏子叶部分），分别接种到Murashige和斯库格（MS）辅以B5的维生素（Gamborg等1968），0.027-0.540.22-4.44 LM苄基腺嘌呤（
7、BA），LM-萘乙酸（Murashige和斯库格1962）酸（NAA），2.89 LM赤霉素（GA3），0.02 LM三碘苯甲酸（TIBA）和0.011 LM烷醇（TRIA）的培养基上诱导初级的体细胞胚。除了MS培养基中生长调节剂，还包括蔗糖（3W / V）和0.01W /V肌醇，培养基的pH值调整到5.7，使用琼脂（0.68）固化。40毫升到150毫升的烧瓶或玻璃瓶在1.21公斤/厘米-2的压力和121 C温度下灭菌20分钟。一百未成熟合子胚（每瓶10）和100不成熟的胚胎茎（每瓶10）被用于实验。二次的体细胞胚的建立和维护主体胚胎获得和二次的体细胞胚的生产分别接种在补充有BA（0.44 L
8、M），萘乙酸（0.054 LM），赤霉素（2.89 LM），TIBA（0.02 LM），TRIA（0.011 LM）而不含琼脂的新鲜的固体和液体MS基本培养基中，分别为，此后，植物生长调节剂组合将简称为RBANGT。间接体细胞胚胎发生愈伤组织，辅以1.07-2.14 LM NAA和10.2 LM BA或0.45-0.90 LM 2，4-D和10.2 LM BA的MS培养基上提出建立从体外胚轴接种幼苗。如表2给出了用于本实验的50外植体（每盘10个）为每个植物生长调节剂组合。从1.07 LM NAA和10.2 LM BA的MS基本培养基中获得四个星期的软易碎愈伤组织培养进一步细分到相同培养基进行
9、维护。因此，获得愈伤组织被用于介导的愈伤组织体细胞胚的生产。愈伤组织建立和维护上述次培养到MS基本液体培养基愈伤组织介导的体细胞胚胎发生与BA（0.44-4.44 LM），硝酸银（40LM），TRIA（0.011 LM）补充;这一媒介成分叫做BAT。体细胞胚胎在体外培养生根二次体细胞胚培养到MS基本培养基液体与BA（0.44 LM），萘乙酸（0.11 LM），赤霉素（2.89 LM），TIBA（0.02 LM），和TRIA（0.011 LM）。RBANGT和生根培养基之间的唯一的区别是，生长素（NAA）的浓度增加了一倍。五十胚胎的团块（* 4个胚胎丛生），用于在体外生根诱导。从根再生体细胞胚植
10、株植根胚苗接种到MS基本固体和液体的媒体辅以BA（0.44-4.4 LM），萘乙酸（0.54-2.69 LM），2IP（4.92 LM），钙的D-泛酸钙（2.1 LM），生物素（0.21 LM），半胱氨酸盐酸盐一水合物（227.7 LM），腺嘌呤硫酸盐（108.6 LM）为他们的进一步增长。农杆菌体外介导法体细胞胚接种到含有不同浓度的潮霉素（2，4，6，8，10，12，14，16，18和20毫克的L-1）的RBANGT培养基用于药敏试验。过滤灭菌的潮霉素20毫克每毫升被用来准备RBANGT中潮霉素不同浓度（Duchefa，荷兰），培养保持在黑暗中的初期为1周。细菌培养转化的准备农杆菌GV310
11、1中菌株含有的二元载体pCAMBIA1305.2用于标准化改造协议。隔夜生长培养物被用于接种25毫升含卡那霉素的LB，生长保持在28和120转速（Gyrotory振荡器SI-600R，Jeiotech，实验室助理，韩国），直到在600 nm处的吸光度为1.0OD值，这些培养物被用于改造与体细胞胚。共培养体细胞胚胎体细胞胚胎生长到1.0外径共培养，农杆菌GV3101中（25毫升的生长密度1.0 OD值）和乙酰丁香酮溶液与100 LM（30,50 - 二甲氧基-40-羟基 - 苯乙酮，Sigma-Aldrich公司，美国）一次震动45分钟，每次间隔10分钟。这些共同培育的体细胞胚印迹干燥下使用层流
12、无菌滤纸，接种到含有10 LMOF乙酰丁香酮RBANGT介质和在黑暗中培养2天。后来，他们组织培养部分中提到的一个正常的光照下保存。一旦细菌过度生长成为可见的，它们分别洗净，用无菌dH2O含有500毫克L-1浓度的头孢噻肟（Duchefa，荷兰）。因此，洗净体细胞胚胎印迹干燥用无菌滤纸和接种RBANGT含有潮霉素（10毫克L-1）和头孢噻肟（250毫克L-1）的培养基上，培养的步骤，选择在生长室。转化子的选择和确认为转化确认，确认使用GUS和hptII的分子引物聚合酶链反应（PCR）的进行，同时，还组织化学GUS测定采用X-glcA确认转基因胚胎的性质。下一步的分子确认和组织化学确认的详细情况
13、。利用PCR和Southern分析分子转化确认从二次体细胞的选择培养基中生长的胚胎的基因组DNA，用于PCR分析确认的T-DNA在植物genome.Forward和反向引物特定部分潮霉素磷酸转移酶（hptII）和葡萄糖醛酸酶（GUS）基因的存在Primer3软体（蔷薇和Skaletsky2000）设计和合成，美国Sigma-Aldrich公司。引物序列如下：HptII F: 5-GAT GTT GGC GAC CTC GTA TT-3HptII R: 5-GTG TCA CGT TGC AAG ACC TG-3Gus F: 5-CCG TCC CAA GCA GTT ACA AT-3Gus R
14、: 5-TTC GGA ATC TCC ACG TTA CC-3扩增反应在量的为25.0 ll，每个含16.0 ll灭菌双蒸水，2.5ll 109缓冲液与15毫摩尔氯化镁，1.0ll的dNTP（dNTP混合液各2.5毫米），2.0ll向前反向引物，Taq聚合酶0.5 ll（* 2.5U）（班加罗尔阁内，班加罗尔，印度），1.0ll模板DNA，扩增反应使用0.2 ml PCR管（爱思进公司）进行一个Eppendorf Mastercycler个人编程的（Eppendorf公司，德国）30个周期进行放大，包括在94C30s，在55C 30s，在72C 1分30秒30，分别称作变性，退火，延伸。这些
15、周期进行之前在94 C有一个2min的初始变性。30个循环后的初始变性2分钟之前，有一个最后延伸725分钟，然后保持在4直到电泳。解决扩增产物，其分子量的基础上，由1.0琼脂糖凝胶基质上运行的产品，使用19 TAE缓冲潜艇电泳（E861康索特，德国），5伏/CM。3 kbp的梯形（MBI的Fermentas公司，德国）被用来确定存在的扩增所需的大小。凝胶染色，并认为在紫外透射。插层剂乙锭溴（310-320纳米）紫外光照射后发出荧光的橙色。使用Herolab文件单位（Herolab易通442 K时，德国），凝胶图像已经被记录在案。假定转化的基因组DNA（约40 LG数量），用EcoRI酶消化So
16、uthern blot分析见于Sambrook等人的报告（1989年）。BioBond-PLUS尼龙膜（美国Sigma公司）和600 bp的GUS基因探针杂交。GUS基因探针的制备用补骨脂生物素标记试剂盒（Ambion公司，美国）。杂交信号进行检测，使用非同位素BioDetect套件（Ambion公司，美国）。使用GUS分析组织化学确认二次体细胞选择培养基上生长的胚胎用于组织化学GUS测定。GUS检测解决方案是从杰斐逊等做了轻微的修改。（1987年），代替磷酸钠缓冲，钾磷酸盐缓冲用来准备的GUS检测解决方案。GUS的检测解决方案假定二次体胚培养在37在杂交炉（1004-2E，谢尔实验室，美国）2天。术后第2天，体细胞胚胎转移至脱色解决方案，以避免叶绿素和其他成分的背景效果可视化蓝色清楚。他们使用尼康数码相机拍摄的。统计分析实验重复3次。复
