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1、脂环酸芽孢杆菌( Alicyclobacillus)的检测与控制,严纪文 Jiwen.y,概述,脂环酸芽胞杆菌(Alicyclobacillus)是脂环酸芽胞杆菌属，革兰阳性(仅有一株为革兰阴性)的芽胞杆菌。 人们根据其耐热、耐酸的特性，俗称为耐热菌、耐热耐酸菌、嗜热耐酸菌、嗜酸耐热菌等。 已有文献报导：脂环酸芽胞杆菌是引起果汁、酸性饮料(尤其是巴氏灭菌的果汁)腐败变质的主要元凶。,1998 年美国国家食品生产者联盟(NFPA)经过调查发现，美国35% 的果汁腐败都与嗜酸的芽胞杆菌有关。 嗜酸耐热菌的在芽孢可橙汁中萌发、生长，也可以在30的苹果汁、葡萄汁中生长良好。 导致果汁产品腐败的嗜酸耐热
2、菌主要是酸土脂环酸杆菌。引起的果汁腐败变质的主要是它的代谢产物。,2000年起，美国及欧洲大部分果汁消费国要求浓缩果汁中脂环酸芽胞杆菌的含量应1CFU/10mL。 2002年起，浓缩果汁中对耐热嗜酸菌的要求为不得检出。,脂环酸芽胞杆菌引起腐败的初期不易发现，产品并不出现明显的涨包或酸败。 因而在低污染时难以检出，但其代谢产物达到万亿分之一的浓度时，就会使果汁口感风味变劣、浊度升高乃至在包装底部形成白色的沉淀等质量危害。 其芽胞还可污染生产中的半成品(浓缩果汁)、生产材料(加工水果)、生产设备。,Walls 等人对酸土环脂芽孢杆菌的致病性进行了研究，他们将含有高浓度酸土脂环酸芽孢杆菌的生理盐水悬
3、菌液0.5ml 注射到小鼠腹膜内，小鼠未表现出任何异常现象，证明在受试浓度内该菌不具致病性。用含菌5106CFU/ m l 的苹果汁饲喂豚鼠，一周后豚鼠仍表现正常。至今未见关于饮用了含脂环酸芽孢杆菌的果汁后导致疾病的病例报道。 小结：脂环酸芽胞杆菌虽然可引起饮料变质，但目前未发现其对人致病。,愈创木酚 愈创木酚，又称邻甲氧基苯酚、2 - 甲氧基苯酚。是用于食品的合成调味料，它可以产生甜、烟熏和烧烤风味。 卤酚 溴酚：包括2，6- 二溴苯酚(2，6- DBP)和2，6- 二氯苯酚(2，6-DCP)，可产生“药味”、“消毒水味”。,脂环酸芽胞杆菌的代谢产物,脂环酸芽胞杆菌的分类与命名,1971年D
4、arland和Brock在美国的酸热环境中分离到芽孢杆菌Bacillus acidocaldarius ，该菌细胞膜中具有独特的-环己烷脂肪酸结构和藿烷化合物结构； 且这种菌只在酸热的环境中存在，将其命名为酸热脂环芽孢杆菌。 不久Hippchen等也在土壤中分离到相似的菌株。,1984年Cerny等在腐败的苹果汁中分离到一株细胞膜中含 -环己烷脂肪酸结构的芽孢杆菌，高度怀疑该菌导致了苹果汁的腐败。 1987年Deinhard 等对包括前述菌株的13株耐热耐酸菌做了结构分析和全面的鉴定。将其中一株与B. acidocaldarius相似的菌株命名为酸土环脂芽胞杆菌(B.acidoterrestr
5、is )。 1992年Wistozkey 等对这些菌株进行了16S rDNA 序列分析将这三株菌从芽孢杆菌属中划分出来，命名为脂环酸芽孢杆菌属( Alicyclobacillus)。,Churey等人1994 年从腐败的苹果汁中发现嗜酸耐热芽胞菌，经鉴定为酸土脂环芽胞杆菌。 Splittstoesser等人从腐败的无菌包橙汁中发现2 株嗜酸耐热芽胞菌，革兰染色阳性，芽孢耐热性D90为1623min，D95为 2.42.8min。,脂环酸芽胞杆菌的模式株：A.acidoterrestris酸土环脂芽胞杆菌。 19982003年，不断有人从南极、亚速尔群岛、日本仙台火山附近的土壤中分离到这类细菌。
6、 至此脂环酸芽胞杆菌属有11个种，1个亚种。该菌属新菌种的发现仍在继续。,脂环酸芽胞杆菌的生化特性,可生存在高温、高酸的条件下。 最适生长温度为4253，生长pH2.06.0。 在某些特殊的培养基中不能生长。如：酸土环脂芽胞杆菌不能生长于含胰酪蛋白胨、牛肉汤琼脂的培养基中，甚至pH达到3.5时也无法生长。 菌株在培养基中45需氧培养 12d即形成明显的菌落。,菌落形态一般为圆形饱满、乳白色、半透明或不透明，直径为0.55mm。 菌体形态为杆状，革兰染色阳性，产芽孢，芽孢呈椭圆形，端生或次端生，有时会使菌体细胞膨大，菌体宽0.351.1m、长26.3m。 好气生长。,对脂环酸芽胞杆菌的生化鉴定常
7、采用API 50CHB鉴定系统。 API 50 CHB鉴定系统采用49 种碳源(糖、醇)，观察芽胞杆菌对其的利用情况进行编码鉴定。但脂环酸芽胞杆菌的部分菌株之间糖利用情况的差异并不显著，往往需要进一步的鉴定。,酸土环脂芽胞杆菌生化反应,目前分离脂环酸芽胞杆菌的常用培养基： BAM( Bacteria Acidocaldarius medium) ； OSA (orange serum agar) ； PDA(patato destrose agar) ，但需调节pH至3.5； YSG(yeast starch glucose) ； K氏培养基； SK琼脂培养基 等。,脂环酸芽胞杆菌的 生长温度
8、、pH范围,嗜酸耐热菌在不同果汁中的抗热性,研究表明： 培养基中的阳离子(Ca+、Mg2+、Ba2+、Mn2+、Sr2+)对嗜酸耐热菌的抗热性无影响。 有机酸的不同(苹果酸、柠檬酸、酒石酸)对嗜酸耐热菌的抗热性无显著性影响。 在8891范围内，当pH值增加约0.6时，D值增加近1倍 可溶性固形物的含量会影响嗜酸耐热菌抗热性，在同样温度时，D值随可溶性固形物的增加而增加。但当温度接近97时，影响不明显。,脂环酸芽胞杆菌的分布 与污染途径,脂环酸芽孢杆菌通常存在于土壤中，在18 70 生长，pH 2 7 存活，当pH 4 时便生出芽孢成为变异细胞，芽孢的耐热能力为85 56min，90 15min
9、，95 2.4min。 通过土壤、灰尘、昆虫等附着在果实表面。 此外，该菌也可以通过其特殊的细胞结构黏附在果实表面。,脂环酸芽胞杆菌检验方法介绍,原理：样品经热处理，去除样品中的非耐热杂菌，取适量样液用0.45um滤膜过滤后，将滤膜贴于培养基中，培养后进行菌落计数，必要时可于显微镜下检查芽孢。 仪器： 恒温水浴：801。 恒温培养箱：401。 灭菌培养皿：直径为90mm。 灭菌试管：18180mm。 滤膜：0.45um水系一次性滤膜。,K氏培养基的配制： 酵母粉 1.25g 蛋白胨 2.50g 葡萄糖 0.5g 吐温80 0.5ml 琼脂 6.50g 蒸馏水 500ml 配制方法：将各成分加入
10、蒸馏水中，溶解后，在121灭菌1525min，冷却至约50 时用经过滤除菌的12.5%的苹果酸(1.25g苹果酸加入10ml蒸馏水，溶解后以0.45m滤膜过滤) 调节pH3.70.1，倾注平板。平板密封后置05 下可保存60d。,样品处理-浓缩汁,以无菌操作分别取10ml浓缩汁于二个15ml灭菌的试管中，其中一管插入温度计(温度控制管)。 将二样品管置80 1 的水浴中，观察温度控制管中温度计的温度，当温度计读数达到80 1时，开始计时，维持13min。水面应高于试管中的样品。 取出后迅速冷却至室温。,用90ml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中，摇匀。将稀释后的样品溶液用0.45um
11、的滤膜真空过滤。 也可根据样品的污染情况，选择合适的稀释度进行过滤。,样品处理-清汁、水,分别取150ml清汁（或水）于二个已灭过菌的玻璃样品瓶中 ，同上操作。 样品冷却至室温，用0.45um的滤膜真空过滤。 也可根据样品的污染情况，选择合适的稀释度进行过滤。,样品处理-浊汁,分别取20ml浊汁于二个已灭过菌的试管中，同上操作。 样品冷却至室温，用0.45um的滤膜真空过滤。 也可根据样品的污染情况，选择合适的稀释度进行过滤。,培养与计数,用灭菌的镊子，将过滤膜从过滤器上取下放在K氏培养基上，保证滤膜与培养基接触，不能留有气泡。 倒置于40 41恒温培养箱中，可在恒温培养箱底部放置一个有水的盘
12、子，以调整恒温培养箱的湿度，培养5d。 培养结束后，记录该培养温度下滤膜上的菌落数。 报告：CFU/10ml。,关于脂环酸芽胞杆菌的检验要点,培养基的pH调节：建议使用苹果酸，浓度可在1020%之间。据文献报导培养基的pH在3.70.1时，耐热菌生长良好。如配制200ml K氏培养基，用0.336g苹果酸即可达到pH3.70.1。 取样量选择原则： 浓缩汁-少取并稀释； 成品料-多取，可不稀释或直接过滤。 注意样品的代表性(视污染情况而定)。,培养基的用量： 因本实验的培养时间较长(5d)，所以每皿培养基的用量应在20ml以上，以避免因培养基水分损失造成细菌不生长。 热处理的温度与时间： 热处
13、理温度多采用80 1，但也有采用74 76 进行热处理。 热处理时间：1020min都有人选择。 选择原则：接近巴氏灭菌的温度与时间，的或产品生产工艺要求的温度与时间。,培养时间与温度： 培养温度：在40 45 ，可根据样品中污染情况选择适宜的培养温度。 培养时间：多数为5d，也有35d。但培养5d更利于芽胞的复苏。 菌落的识别： 脂环酸芽胞杆菌在K氏培养基上的菌落大多为奶油色，轻微的凸起 ，不透明。 生长速度很快，有时24h即可形成芽胞，必要时可镜检芽胞。 芽胞多位于菌体的顶端或中部。,注意实验过程的不确定度： 在同样的条件（人员、仪器设备、实验室相同、短暂的时间间隔）下，同一个实验样品检测
14、两次的结果的差异应5%。 在不同的条件（人员、仪器设备、实验室、时间不同）下，同一个实验样品检测两次的结果应15%。,耐热霉菌检验方法介绍,仪器： 培养箱，温度设在 301 水浴锅，温度设在4446 水浴锅，温度设在801 无菌培养皿（150mm15mm） 牛奶稀释瓶 封口膜,培养基与试剂： PDA培养基：临用时冷却至46 ，每100ml培养基中加入经过滤除菌的10%酒石酸1ml，调节pH至3.50.1。 10%酒石酸的配制：称取10g酒石酸于 90ml蒸馏水中溶解后，用0.45um的滤膜真空过滤。于室温保存。 MEA培养基。 乳酸酚棉蓝染色液（Lactophenol Cotton Blue
15、Stain）。 无菌水 。,样品的处理,浊汁及浓缩果汁：以无菌操作，分别取50ml检样于二个无菌稀释瓶中，再添加50ml无菌蒸馏水。其中一检样插入温度计(温度控制管)。 清汁：以无菌操作，分别直接吸取100ml检样于二个无菌瓶中。其中一检样插入温度计(温度控制管)。 将上述样品同时放入80的水浴中。,当温度控制瓶的温度达到801时开始计时，维持30min。 将出样品瓶放入冰浴中冷却后，吸取样液平均注入到8个无菌培养皿中。 每个培养皿注入3540ml PDA琼脂，同时作空白试验。 培养基凝固后，倒转培养皿，放入30的培养箱内培养14d。 培养结束后，计数8个平板上所有的菌落数。,结果报告,浊汁及
16、浓缩果汁以cfu/50ml报告。 清汁以cfu/100ml报告,关于耐热霉菌的检验要点,计数时应注意剔除细菌、酵母菌落数。 霉菌菌落的确认： 将可疑菌落以点种的方式分别接种二个MEA平板中，一个置25 培养，一个置37 培养，培养7d。 观察菌落的颜色，结构，菌丝体颜色，可溶性色素（如果产生）和分泌物颜色（如果产生）。 必要时用乳酸酚棉蓝染色液染色镜检。低倍镜下观察菌丝结构、油镜下观察孢子。,真菌实验室污染的防护,霉菌孢子容易随空气飘扬，稍一震动就可产生喷发式的扩散，而造成空间的污染。 一般要求霉菌、酵母检验应在独立的实验室进行。 进行实验时，应尽量保持实验室安静，减少空气流动。 观察结果时动作要轻。尤其是提前观察结果时要避免次生菌落的产生。,实验后，尤其是大量培养后要做好消毒。除在第一时间将霉菌培养物灭菌外，还要对培养箱、接种箱、实验室进行消毒
