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1、单克隆抗体分析表征旨在提高生产率和生产量的创新技术及工作流程Thermo ScientificBioLC 色谱柱目录单克隆抗体表征. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2单克隆抗体表征的典型流程. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4单克隆抗体滴度测定 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5采用离子交换色谱法进行的电荷变体分析. . . . . . . . . . . . . . 6用于聚合物筛分的尺寸排阻色谱法 . .
2、 . . . . . . . . . . . . . . 11单克隆抗体分析中采用的疏水作用色谱法. . . . . . . . . . . . . 12完整抗体或碎片的分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14用于单克隆抗体变体表征的聚糖分析 . . . . . . . . . . . . . . . 16使用超高效液相色谱 ( UHPLC ) 进行生物分子表征 . . . . . . . . 18单克隆抗体分离及表征的LC-MS工作流程. . . . . . . . . . . . . 20订购信息 . . . . . . . . .
3、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22蛋白质和单克隆抗体 ( mAb ) 生物药品是日益发展的生物制药市场的主要组成部分，过去十年它使生物技术和生物制药行业发生了重大转变。单克隆抗体治疗是一种最有效的疾病诊断和治疗方法，其涉及疾病范围较广，包括自体免疫性疾病、心血管疾病、传染性疾病、癌症及各类炎症。蛋白质和单克隆抗体( mAb) 治疗的研发渠道非常广泛，这进一步强调了对创新性和高效分析工具的需求。在此类药品的研制和生产过程中，对杂质以及结构变体和结构改性进行检测、表征和定量，并对产品稳定性进行监控是必不可少的。这正是展示产品安全及功效的关键所在，
4、也是美国食品和药物管理局( FDA) 、欧洲药品评价局( EMEA) 、( 中国) 国家食品药品监督管理局( CFDA) 等机构所提出的要求。单克隆抗体表征要求 蛋白质特性表征所需技术推荐的色谱柱批放行测试所需技术推荐的色谱柱表征的进一步要求推荐的色谱柱尺寸SEC MS( 完整蛋白质谱分析) MAbPac SEC-1 SEC MAbPac SEC-1杂质；片段/聚合物MAbPac SEC-1电荷IEC pH-IEC MAbPac SCX-10 MAbPac SCX-10 RS pH 梯度缓冲液IEC pH-IEC MAbPac SCX-10 MAbPac SCX-10 RS pH Gradie
5、nt Buffers酰化作用、脱酰胺基作用，唾液酸化变体MAbPac SCX-10 MAbPac SCX-10 RS疏水性HIC MABPac HIC-10ProPac HIC-10ADC 分析脱酰胺基作用氧化作用MABPac HIC-10ProPac HIC-10结构表征(2ry和3ry结构)反相ProSwift RP-2H ProSwift RP-4H 二硫化物图谱ProPac HIC-10ProSwift RP-2H ProSwift RP-4H 鉴定(肽图)反相Accucore 150-C18 PepMap 100 C18反相Accucore 150-C18 PepMap 100 C1
6、8聚糖分析荧光标记：混合模式AX-HILIC混合模式AX-反相HILIC GlycanPac AXH-1GlycanPac AXR-1Accucore Amide-HILIC 混合模式AX-HILIC混合模式AX-反相HILICGlycanPac AXH-1GlycanPac AXR-1Accucore Amide-HILIC异质性GlycanPac AXH-1GlycanPac AXR-1原生聚糖：混合模式AX-HILIC混合模式AX-反相GlycanPac AXH-1GlycanPac AXR-1单克隆抗体表征2单克隆抗体通常表现出复杂的微观不均一性。由于存在这种翻译后修饰 ( PTM )
7、 的可能性，针对单克隆抗体的质量控制和稳定性评估将会成为非常具有挑战性的任务。 液相色谱法已经成为用于单克隆抗体生物治疗药物表征的一个必备工具。 物理化学特性N-末端异质性 焦谷氨酸成盐氨基酸修饰 脱酰氨基作用、氧化作用、糖基化反应、异构化反应裂解 铰链区内的分裂4,SSSSCOO-Fab Fc CH3CH2-S-S-S-S-S-S-NH3+SSSSSSSS_NH3+CH1VHCLVLG低聚糖 岩藻糖基化、半乳糖基化、唾液酸化作用二硫键 自由硫醇、二硫键改组、硫醚C-末端异质性 赖氨酸加和、脯氨酸酰胺化3通常情况下，第一步 ( 1A ) 是利用protein A对收获细胞培养液 ( HCCF
8、) 中的mAb或IgG进行提纯，然后 ( 2A ) 利用SEC进行聚合物分析，最后 ( 3A ) 利用IEC进行电荷变体分析。出于这一原因，上述分离模式构成了单克隆抗体研发分析的主要部分。上述工作流程通常包含以下变化： 利用分析型protein A进行最初IgG效价检测( 1B) ，进行上样量计算 ( 2B) ，随后进行稀释 ( 3B) 并进入制备protein A阶段 ( 4 ) 。 一种可选的羧肽酶B( CpB) 消解，用于IEC分离之前的末端赖氨酸移除( 5) 。 预收集工具，用于通过交错型SEC( 6) 或HIC( 7) 进行进一步PTM分析。 纯化后的IgG 消解后用于肽图分析，用于
9、更加详细的表征和质谱分析( 8) 。 纯化IgG用糖基肽酶 ( 或其它类型的糖苷酶 ) 处理，用于聚糖分析 ( 9 ) 。用户可将这些分离技术结合起来，以完成更广泛的分析任务，如： 纯度和效价检测 聚合物分析 电荷变体分析 发酵监测 剪断和截断 轻链/重链分析 肽图谱 聚糖分析 翻译后修饰分析( 氨基酸置换/截断、脱酰氨基作用、磷酸化作用等) 完成上述每一项分析任务均须认真选择色谱法以达到最优结果。我们可支持生物制药行业的科研人员通过使用可产生优异、可靠结果的整体解决方案以达到上述目标。单克隆抗体表征的典型流程1B3A42B3B1AtProtein AsOSEC&YYI#XeProtein A
10、20jtProtein AsOiziCpBiN#q! TEC! TECFN90C! JECqI!1! JECtYI(YIG9sO:G9sO:e65789IECIJDRPznLC/MS,LC/ pI)345678910 2 (pI) = 0采用离子交换色谱法进行的电荷变体分析67单克隆抗体要经历多个翻译后修饰过程，包括氧化作用、脱酰胺基作用、糖基化反应、不完全C-末端处理等。这些修饰过程会导致克隆过程中的抗体发生变异，其反过来影响单克隆抗体作为一种生物治疗剂的活性和稳定性。对单克隆抗体治疗剂稳定性进行监控，在证明抗体作为一种药物的安全性和功效方面发挥着至关重要的作用。大多数抗体的pI均处于6-1
11、0的pH值区间，这正是阳离子交换通常选择适合于单克隆抗体带电变体的分离模式的原因所在。可以使用一系列阳离子交换MAbPac色谱柱专门用于分离单克隆抗体变异体以及其它受电荷影响的变体。针对单克隆抗体异质性最重要也最常见的分析方法是对酸性和碱性变体进行监控和测定。Thermo Scientific MabPac SCX-10色谱柱分离经羧肽酶B孵育后的赖氨酸缺失变异体。mAU t0 10 20 30 40 50 58 0 27.5 #(!2#(!311 10 9 8 7 6 5 4 6 5 4 3 2 1 3 2 1 9 色谱柱: MAbPac SCX-10, 10 m 4.0 250 mm流动相
12、 A: 20 mM MES (pH 5.6) + 60 mM 氯化钠流动相 B: 20 mM MES (pH 5.6) + 300 mM 氯化钠梯度: 50分钟内1536% 流速: 1 mL/min进样量: 5 L温度: 30 nullC检测波长: 280 nm样本: 1. mAb B, 100 L中900 g( 无羧肽酶) 2. mAb B, 100 L中900 g+50 g羧肽酶，在37 nullC下培养3小时两个色谱图: 峰 15: 酸性变体样本 1: 峰 6-8：C-末端赖氨酸丢失变体 峰 9-11：C-末端赖氨酸丢失变体样本 2: CBP处理后从峰6、7、8中得到峰6 CBP处理后从
13、峰9、10、11中得到峰 90.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 67.0 -5.0 10.020.0 35.01 2 34 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 tmAU色谱柱: MAbPac SCX-10, 10 m 4.0 250 mm流动相 A: 20 mM MES (pH 5.6) + 60 mM 氯化钠流动相 B: 20 mM MES (pH 5.6) + 300 mM 氯化钠梯度: 60分钟内555% 流速: 1 mL/min进样量: 10 L温度: 30
14、nullC检测波长: 280 nmMAbPac SCX有更小颗粒提供，大大加快分析速度。t8色谱柱: A) ProPac WCX-10, 4 250 mm B) MAbPac SCX-10, (10 m) 4 250 mm C) MAbPac SCX, 3 m, 4 50 mm流动相 : A: 20 mM MES + 60 mM NaCl, pH 5.6 B: 20 mM MES + 300 mM NaCl, pH 5.6梯度 : A) 2546.44% B in 50 min B) 1536.44% B in 50 min C) 2035% B in 10 min流速: 1 mL/min (
15、0.6 mL/min for C)进样量: A 和 B: 5 L (50 g) C: 15 L (15 g)温度: 30 nullC检测波长: 280 nm样品: MAb; A 和 B) 10 mg/mL C) 1 mg/mL峰： 1-5: 酸性变异体 6, 8,11: 赖氨酸丢失变异体 12-16: 碱性变异体9采用离子交换pH梯度的平台法在快节奏的药物研发环境下，采用一种适应大多数单克隆抗体分析的平台法是较为理想的。然而，对某种用于个别单克隆抗体阳离子交换分离的盐梯度法进行调整，经常需要付出大量的努力。通过pH梯度进行的离子交换分离能够使一种通用型平台法具备一定优势，因此不再需要针对个别样本制定分析方法。这种方法的特点是使用多组分两性离子缓冲系统，其线性梯度可从100%洗脱液A( 低pH值缓冲液) 的水平变化至100%洗脱液B( 高pH值缓冲液) 的水平。一旦在首次运行中确立了目标单克隆抗体的大致pH洗脱范围，便可在一个较窄的pH值范围内使用
