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1、加巴喷丁对奥沙利铂诱发外周神经痛小鼠背根神经节神经元高电压激活钙电流的作用作者单位： 宗剑 徐州医学院江苏省麻醉学重点实验室 电话：通讯作者：段满林，南京军区南京总医院麻醉科Email：.【摘要】 目的 观察加巴喷丁对奥沙利铂诱发外周神经痛小鼠行为学的作用及加巴喷丁对奥沙利铂诱发外周神经痛小鼠背根神经节高电压激活钙电流的影响。方法 清洁级雄性昆明小鼠60只，单次腹腔注射奥沙利铂3mg/kg制备外周神经痛模型，建模成功动物随机分为正常组（10只）、奥沙利铂模型组（20只）和加巴喷丁处理组（21只）。Von Frey法测定小鼠后肢压力回缩阈值。全细胞膜片钳技术测定急性分离小鼠背根神经节神经元高电压
2、激活钙电流，计算峰值电流密度，拟合激活和稳态失活曲线，计算半数激活电位和半数失活电位。结果 与正常组比较奥沙利铂模型组小鼠后肢压力回缩阈值显著减低(P0.05)，与奥沙利铂模型组比较加巴喷丁处理组小鼠后肢压力回缩阈值显著增高(P0.05)，基本恢复至正常水平(P0.05)。与正常组比较奥沙利铂模型组钙电流峰电流密度显著增加(P0.05)，与奥沙利铂模型组比较加巴喷丁处理组钙电流峰电流密度显著减低(P0.05)，基本恢复至正常水平(P0.05)。三组的半数激活电位差异无统计学意义(P0.05)，奥沙利铂组半数失活电位与其他两组比较明显增大(P0.05)，正常组和加巴喷丁组半数失活电位差异无统计学
3、意义(P0.05)。结论 对于奥沙利铂诱发的外周神经痛加巴喷丁具有治疗作用，该作用可能是通过改变背根神经节神经元高电压激活钙通道失活动力学特性，抑制背根神经节神经元高电压激活钙电流实现的。【关键词】加巴喷丁；奥沙利铂；神经病理性疼痛；背根神经节；钙通道Effects of gabapentin on high voltage active calcium currents in dorsal root ganglion neurons of oxaliplatin-induced peripheral neuropathic pain miceZONG Jian*,WANG Qiang, et
4、 al. * Department of Anesthesiology, Xuzhou Medical College, Jiangsu Key Laboratory of Anesthesiology, Xuzhou , ChinaCorresponding author：DUAN Man-lin, Department of Anesthesiology, Nanjing General Hospital of Military Command, Nanjing, , China,Email:【Abstract】 Objective To investigate the effect of
5、 gabapentin on oxaliplatin induced peripheral neuropathic pain in mice and the effect of gabapentin on high voltage active calcium currents in the dorsal root ganglion neurons from mice of neuropathic pain induced by oxaliplatin. Methods Pathogen-free male KM mice were used in this study. The animal
6、s were single injected with 3mg/kg oxaliplatin intraperitoneal to prepare the animal model of peripheral neuropathic pain induced by oxaliplatin. After the success of modeling ,animals were divided into normal group, oxaliplatin group and the gabapentin treatment group randomly. Use the Von Frey fil
7、ament to evaluate the mechanical withdrawal threshold 0f mices hindlimb . High voltage active calcium currents of the acutely isolated dorsal root ganglion of mouse was recorded using whole-cell patch clamp technique . Calculated the peak current density, and fitted activation and inactivation curve
8、, and calculated half activation potential and the potential of half inactivation. Results the mechanical withdrawal threshold of oxaliplatin group was significantly lower than the normal group （P0.05）.compared with oxaliplatin group, the mechanical withdrawal threshold of gabapentin treatment group
9、 was significantly increased （P0.05）, recovered to normal levels almost （P0.05）. The peak current density of high voltage activated calcium current of oxaliplatin group was increased significantly contrast to the normal group （P0.05）. the peak current density of high voltage activated calcium curren
10、t of gabapentin treatment group was lower than oxaliplatin group （P0.05）,recovered to normal levels almost（P0.05）.There was no significant difference in the half activation potential among the three groups. The half inactivation potential of oxaliplatin group was significantly increased contrast to
11、the other two groups（P0.05）, there was no significant difference in the half inactivation potential among the normal group and the oxaliplatin group. Conclusion Gabapentin has the therapeutic effect on oxaliplatin-induced peripheral neuropathic pain. The underlying mechanism may be changing the inac
12、tivation properties of high voltage activated calcium channel, and inhibiting the high voltage activated calcium current of dorsal root ganglia neurons . Key words Gabapentin；oxaliplatin ；neuropathic pain; dorsal root ganglion;calcium cuurent 临床上奥沙利铂多用于复发性或转移性结肠、直肠癌的化疗1，作为一种铂类化合物奥沙利铂具有神经毒性的副作用。部分患者在
13、接受奥沙利铂治疗中会出现不伴有运动功能障碍的疼痛表现，部分患者因不能耐受这种感觉异常而无法完成规范的治疗。研究表明加巴喷丁对于多种神经病理性疼痛均有较好的治疗作用 2。但目前加巴喷丁对于化疗药诱发的外周神经痛的研究尚不深入。本实验中我们单次腹腔注射奥沙利铂3mg/kg建立奥沙利铂诱发的外周神经痛小鼠模型3。测定两侧后肢机械压力回缩阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT），观察加巴喷丁对奥沙利铂诱发外周神经痛小鼠MWT的作用。使用全细胞膜片钳技术观察加巴喷丁对奥沙利铂诱发外周神经痛小鼠背根神经节（dorsal root ganglion DRG）神经元高电压
14、激活(high voltage active HVA)钙电流的作用。以评价加巴喷丁对奥沙利铂诱发外周神经痛作用，并探讨其可能的机制。材料与方法雄性昆明小鼠，体重2025g，6周龄。购于南京军区南京总医院实验动物中心。动物饲养于环境温度2026，相对湿度4070%，12小时光照轮替，自由进食及饮水。60只动物随机取50只给予奥沙利铂（南京制药厂有限公司，批号），溶于生理盐水至0.2mg/ml，3mg/kg腹腔注射制备奥沙利铂诱发外周神经痛动物模型。造模后连续测定小鼠两侧后肢MWT，每天一次。在给药后的第三天共有41只小鼠MWT从给药前的9.710.65g显著降低至 3.880.51g P0.05
15、，该41只小鼠为造模成功。将这41只建模成功小鼠随机分为奥沙利铂模型组（20只）和加巴喷丁处理组（21只），再加上原有10只正常小鼠作为正常对照组。加巴喷丁处理组于分组当天即开始腹腔注射加巴喷丁（Sigma），加巴喷丁溶于生理盐水至10mg/ml，100mg/kg，每天一次，连续3天。奥沙利铂模型组及正常组给予等体积生理盐水腹腔注射，每天一次，连续3天。实验过程中所有动物均于每天固定时间测定MWT。将小鼠分别放置于金属筛网上的有机玻璃箱里，安静15 min，以Von Frey纤维分别垂直刺其两侧后肢足底中部皮肤，持续4 S，小鼠出现抬足，舔足，躲避等反应时，记录ElectroVonFrey读数
16、器上显示的最大值(g)，每只小鼠每侧后肢重复测量5次，间隔5 min，去除最大和最小值计算3次的平均值即为该小鼠的MWT。所有小鼠在是实验过程中每天测一次体重，并观察小鼠一般情况。所有小鼠均于最后一次MWT测定后颈椎脱臼断头处死，迅速取出两侧L4、L5DRG，放入0预充氧气的DMEM培养液（g/L：DMEM 13.4、NaHCO3 3.7，NaOH调pH值7.3）中，分离出DRG。将DRG放入型胶原蛋白酶（Sigma 4 mg/1.5ml）和型胰蛋白酶（Sigma 1.5 mg/1.5ml）的混合液中，36.5孵育25 min。标准细胞外液（mmol/L：NaCl130、KCl5、CaCl22 、MgCl22、HEPES 10、D-glucose 10，用NaOH调pH值至7.3）清洗5遍以终止酶消化。轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。将细胞悬液置于35mm培养皿中，
