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1、 消毒剂消毒效果验证消毒剂消毒效果验证 编号：编号： 版次：版次： 年年 第第 版版 目目 录录 1. 概述 2验证目的 3. 验证内容 4. 验证组织 5. 验证实施步骤 6. 验证的主要依据 7验证合格标准 8再验证周期 9附录 9.1 验证方案会审记录 9.2 漏项和偏差处理记录 9.3 验证方案修改申请及批准书 1 1概述：概述： 洁净区用消毒剂对地漏、地面、墙面、操作台、设备表面及非灭菌容器具 表面等进行消毒，旨在控制微生物污染水平，防止微生物在药品生产环境中污 染及交叉污染，保证生产环境符合工艺卫生要求，最终保证药品质量。本公司 车间洁净区分为十万级、万级、万级下的局部百级，所使用
2、的消毒剂种类及使 用对象如下图所示： 消毒剂名称 所使用对象 75%乙醇、 直接接触药品的设备表面、手部 0.2N 氢氧化钠溶液 只用于生产二部混合设备内表面的消毒 0.2%新洁尔溶液 地漏、地面、墙面、操作台、设备外表面、手部 0.05%洗必泰溶液 地漏、地面、墙面、操作台、设备外表面、手部 我公司产品为微生态活菌制剂，活菌数数量巨大，为防止交叉污染，确认 用此消毒剂消毒后生产环境内物体表面不残留控制菌和目的菌， 保证我们使用 的消毒剂能够对目的菌起到强抑制作用，能达到预期的消毒效果，必须对消毒 剂的消毒效果进行验证。 本方案结合生物指示剂挑战性试验 （特定菌挑战试验） 和现场考察试验，对消
3、毒剂的杀菌效力进行确认。 2 2验证目的：验证目的： 确认洁净区按照规定的清洁、消毒程序进行清洁消毒后，能够达到防止交 叉污染的目的，并在消毒有效期内能确保达到生产工艺所需要的效果。 3 3验证内容：验证内容： 本验证先在实验室对所使用的消毒剂， 用六种控制菌和四种目的菌做生物 指示剂挑战性实验；然后做现场消毒考察实验，即现场消毒后用棉签取样法对 消毒后的表面取样，做表面残留微生物限度检查。通过对指示菌的杀灭对数值 和现场消毒后洁净区表面微生物的残留限度来确认消毒剂的消毒效果。 4 4验证组织：验证组织： 4.14.1 验证小组：验证小组： 部 门 职 务 职 责 组 长 质保部 部门负责人
4、负责成立验证小组，明确各验证成员职责； 负责组织起草验证方案、验证记录和验证报 告；负责验证方案、验证记录和验证报告的 审核工作。 组 员 质保部 验证管理员 负责起草验证方案；负责对试验结果进行统 计分析；负责起草验证报告。 质保员 负责现场取样；负责验证过程在线监督 质检部 部门经理 负责组织对样品的检验；负责验证所需试 剂、试液等的准备。 质检部 质检员 负责样品的检验；负责检验数据的收集、整 理。 生产部 部门经理 负责组织现场操作，确保验证按进度进行。 生产部 卫生员 负责消毒液的配制和发放。 生产部 各工序 操作人员 负责洁净厂房的清洁；负责按消毒程序进行 消毒。 设备部 部门经理
5、 负责仪器、仪表、量具的校正；负责验证所 用仪器、设备的安装、调试，并做好相应的 记录；负责纯化水的供给。 4.24.2 验证委员会验证委员会： 4.2.1 人员组成：由企业质量副总、生产副总及生产部、质量保证部、质量检 验部、设备动力部经理或主管组成。 4.2.2 职责： 4.2.2.1 负责验证方案的审批。 4.2.2.2 负责验证的协调工作，以保证验证方案的顺利实施。 4.2.2.3 负责验证数据及结果的审核。 4.2.2.4 负责验证报告的审核。 4.2.2.5 负责确定该项验证的再验证周期。 4.2.2.6 负责验证证书的发放 5.5.验证实施步骤验证实施步骤： 5.15.1 验证前
6、准备验证前准备：在进行消毒剂消毒效果验证前，洁净厂房空气净化系统应经 验证合格并正常运行，设备动力部应提供洁净厂房空气净化系统的验证报告、 空气净化系统操作程序；与验证相关的各种设备、仪器均需通过相应验证，所 需仪表、计量器具均需校验合格并具备校验证书。 5.25.2 验证所需文件资料验证所需文件资料： 表 1. 验证所需的文件资料及存放处（待定） 验证所需文件资料及存放处 资料名称 编号 存放处 活菌数检测操作规程 ZL-03-066 GMP 办公室 菌落计数操作规程 ZL-03-070 GMP 办公室 培养基配制操作规程 ZL-03-073 GMP 办公室 培养基配制、使用管理规程 ZL-
7、03-110 GMP 办公室 消毒剂配制操作规程 WS-04-029 GMP 办公室 消毒剂的使用操作规程 WS-04-030 GMP 办公室 致病菌阳性菌株传代操作规程 ZL-03-075 GMP 办公室 实验器具清洗操作规程 ZL-03-087 GMP 办公室 实验器具灭菌、消毒及使用操作规程 ZL-03-088 GMP 办公室 进出微生物限度实验室操作规程 ZL-03-259 GMP 办公室 CHK 型显微镜操作规程 SB-03-153 GMP 办公室 厌氧罐操作规程 SB-03-156 GMP 办公室 MS1 型振荡器操作规程 SB-03-381 GMP 办公室 BL610 型电子天平
8、操作规程 SB-03-324 GMP 办公室 SKP-02B 型电热恒温箱操作规程 SB-03-375 GMP 办公室 SKP-02B 型电热恒温箱清洁规程 SB-03-376 GMP 办公室 微生物实验室清场操作规程 ZL-03-064 GMP 办公室 破伤风杆菌检测操作规程 ZL-03-220 GMP 办公室 DELTA-320PH 计操作规程 SB-03-234 GMP 办公室 致病菌阳性菌管理规程 ZL-03-112 GMP 办公室 微波炉的操作规程 SB-03-177 GMP 办公室 洁净区情场操作规程 设备清洁操作规程 5.35.3 器材器材与试剂与试剂 5.3.1 菌株 （1）细
9、菌：金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 大肠杆菌 （2）细菌芽孢：枯草杆菌芽孢 （3）真菌：白色念珠菌 （4）四种目的菌：长双歧杆菌 保加利亚乳杆菌 嗜热链球菌 德氏乳杆菌 5.3.2 培养基（需化验室帮助确定） 营养肉汤培养基、营养琼脂培养基 等 5.3.3 稀释液：1%蛋白胨-PBS 溶液 5.3.4 中和剂：0.1%卵磷脂+1%吐温 80 溶液； 营养肉汤 5.3.5 无菌载片：12mm 直径圆形不锈钢片 5.3.6 无菌试管 5.3.7 无菌平皿(90mm) 5.3.8 含玻璃珠的无菌三角瓶 5.3.9 消毒剂：75%酒精，0.2%新洁尔灭，0.05%洗必泰，0.2N 氢氧化钠 5.3.10
10、 移液器及配套无菌吸头:0-100ul，100-1000ul 5.3.11 计时器 5.3.12 净化工作台 5.3.13 电动混合器 5.3.14 恒温培养箱 5.3.15 人工菌落计数器 5.55.5 中和剂鉴定试验中和剂鉴定试验 5.5.1 细菌和真菌菌液制备 接种金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基 （或高盐甘露醇培养 基）中，3035培养 18-24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖 培养基中，2328培养 18-24h。将上述培养物用稀释液稀释至所需浓度备 用。 5.5.2 枯草杆菌芽孢悬液的制备 5.5.2.1 取枯草杆菌新鲜培养物（18-24h）适量至营养琼脂培养
11、基斜面，使菌 液布满营养琼脂培养基斜面，再将多余的培养物吸出，将斜面置于 3035 培养 57 天。用接种环取菌样少许涂于玻片上，进行芽孢染色镜检。当芽孢 形成率达 95以上时，即可进行以下处理。否则，应继续在室温下放置一定 时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。 5.5.2.2 加适量无菌水于每一营养琼脂培养基斜面试管内，以接种环轻轻推刮 下菌苔。吸出第一批洗下的菌悬液，再取适量无菌水于营养琼脂培养基斜面， 重复洗菌一遍。 将第一和第二批洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧 瓶内，振摇 5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。 5.2.2.3 用无菌棉花或纱布过滤芽孢悬液，清除其
12、中的琼脂凝快。 5.2.2.4 将过滤后的芽孢悬液放于 80水浴中 10min 以杀灭残余的细菌繁殖 体。待冷至室温后，保存于 4冰箱中备用。有效使用期为半年。 5.2.2.5 芽孢悬液在使用时，应先进行活菌计数。 5.5.3 染菌载片制备 5.5.3.1 载片脱脂处理：将载片放在含肥皂的水中煮沸 30min，以纯化水 洗净，用纯化水煮沸 10min，用蒸馏水漂洗至 pH 中性晾干备用。 5.5.3.2 菌液滴染：将经灭菌的载体平铺于无菌平皿内，滴加 105cfu/ml 的菌 液 10ul，并用接种环涂匀整个载体表面。滴染菌液后，载体置 37温箱内干 燥约 20-30min 后再使用。 5.5
13、.4 中和剂鉴定操作程序 5.5.4.1 根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。 第 1 组：用无菌镊子取一染菌载片移入含有 10ml 中和剂的试管中。作 用 10min 后，用电动混合器混合 20s，或将试管振打 80 次，混匀，分别吸取 1.0ml，接种于两个平皿中，做活菌计数。细菌放 3035培养 48h，芽孢放 3035培养 72h，真菌放 2328培养 72h 观察最终结果。 第 2 组：用无菌镊子取一染菌载片移入含有 10ml 中和产物（以浸有 消毒剂的无菌载片置 10ml 中和剂内，作用 10min）的试管中。作用 10min 后， 用电动混合器混合 20s，或将试管振
14、打 80 次，混匀，分别吸取 1.0ml，接种于 两个平皿中，做活菌计数。细菌放 3035培养 48h，芽孢放 3035培养 72h，真菌放 2328培养 72h 观察最终结果。 第 3 组：用无菌镊子取一染菌载片移入含有 10ml 稀释液的试管中。作 用 10min 后，用电动混合器混合 20s，或将试管振打 80 次，混匀，分别吸取 1.0ml，接种于两个平皿中，做活菌计数。细菌放 3035培养 48h，芽孢放 3035培养 72h，真菌放 2328培养 72h 观察最终结果。 第 4 组：分别吸取稀释液和中和剂各 1.0ml 于同一无菌平皿内，加入 上述试验同批次的培养基 15-20ml
15、，培养观察。 5.5.4.2 判定标准：实验结果符合以下全部条件，所测中和剂可判为合格： 第 1、2 和 3 组有相似量试验菌生长，其组间菌落数误差率不应超过 15%。第 1、2 和 3 组菌落数误差率计算公式如下： （3 组间菌落平均数-各组菌落平均数）的绝对值之和 误差率×100 3×3 组间菌落平均数 第 4 组无菌生长。否则，说明试剂有污染，应重新进行试验。 5.5.5.3 结果记录 附件 1：中和剂鉴定试验结果记录 5.65.6 载体定量杀灭试验载体定量杀灭试验 5.6.1 将菌液用稀释液稀释成 10 8cfu/ml 的菌悬液。 5.6.2 取已灭菌的载体放于无菌
16、平皿内， 每种微生物试验用载体分“5 分钟组“、 “10 分钟组“和“15 分钟组“共 3 组。 5.6.3 滴染 10 8cfu/ml 的菌悬液 10ul 于无菌载体上，载体置 37温箱内干燥 约 20-30min 后再使用。 5.6.4 用无菌镊子将染菌载体加入含有消毒剂的平皿中，作用至规定时间，将 染菌载体移入含有 10ml 中和剂的试管内，用电动混合器混合 20s，或将试管 振打 80 次，使菌片上的微生物被洗脱进入中和液内，再放置 5 min，使中和 作用充分。最终进一步混匀，适当稀释，分别吸取 1.0ml 接种于两个平皿中， 做活菌计数。细菌放 3035培养 48h，芽孢放 3035培养 72h，真菌放 2328培养 72h 观察最终结果。 5.6.5 另取一平皿，注入 10ml 稀释液代替消毒剂，放入染菌载片，
