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1、摘要： 来自通用电气医疗集团（GE Healthcare）的谷胱甘肽硫转移酶（GST）基因融合系统是一种表达、纯化和检测大肠杆菌中所产生的GST标签蛋白的多功能系统。系统包括三个主要成分：pGEX质粒表达载体、GST纯化的产品以及一系列GST检测产品。一系列切割GST标签的位点特异蛋白酶则是该系统的补充。GST亲和标签实现了温和的纯化过程，不会影响蛋白的天然结构和功能。GST基因融合系统的优势包括： 所有pGEX载体带有tac启动子，实现化学诱导的高水平表达 温和、非变性的缓冲液成分，以分离活性蛋白 基于Glutathione Sepharose填料的亲和层析产品实现了从微克到克规模样品的一步
2、纯化 方便的预装柱形式适合单个样品或平行筛选多个重组克隆 pGEX载体上的PreScission 蛋白酶、凝血酶或Xa因子识别位点能将目的蛋白从融合产物中切割下来 利用抗-GST抗体轻松检测融合蛋白在天然情况下，GST以分子量26,000的蛋白存在，它在大肠杆菌中的表达产物具有完全的酶活。经过鉴定，pGEX载体的重组日本血吸虫（Schistosoma japonicum）GST的晶体结构与天然蛋白一致。pGEX质粒载体将基因或基因片段与GST融合后，在细胞内高水平诱导表达。重组蛋白很容易利用Glutathione Sepharose填料通过亲和层析从比如大肠杆菌细胞裂解液中纯化（图1），要么是
3、预装柱，要么是分批纯化。图1. Glutathione Sepharose High Performance、Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 以及Glutahione Sepharose 4B目前都有大包装填料，预装柱以及多孔板，用于GST标签蛋白的纯化。利用位点特异的蛋白酶，可实现目的蛋白与GST的切割，此蛋白酶的识别位点位于pGEX载体上多克隆位点的上游。GST标签的切除是在柱中进行的，作为纯化步骤或纯化后离线的一部分。重组蛋白可利用GST检测模块中提供的免疫分析来检测，或用抗-GST抗体在Western blotting中检测，或通过比色分析来检测。p
4、GEX载体通过将一个基因或基因片段插入某个pGEX载体的多克隆位点，可构建出GST标签蛋白。载体提供了三种翻译读码框，从EcoRI限制性酶切位点开始（详见表1）。pGEX载体是为基因或基因片段的高水平细胞内诱导表达而设计的。大肠杆菌中的表达产生了标签蛋白，GST部分在氨基端，目的蛋白在羧基端。目前有13个pGEX载体（详见图2）；所有载体都有tac启动子，用于高水平的化学诱导表达，以及内部的lac1q基因，在任何大肠杆菌宿主中使用。图2. 谷胱甘肽硫转移酶融合载体的图谱，显示出读码框和主要特征。所有13个载体在三种读码框内多克隆位点的下游都有终止密码子。（此图谱中未指出）。9个载体有扩展的多克
5、隆位点（MCS），含有6个限制性酶切位点。扩展的MCS有助于从多种市售载体的文库构建物中获得的cDNA片段的定向克隆。pGEX-6P-1、pGEX-6P-2和pGEX-6P-3都在GST结构域和多克隆位点之间编码了PreScission蛋白酶的识别位点，用于位点特异的切割。pGEX-4T-1、pGEX-4T-2和pGEX-4T-3都来自pGEX-2TK，含有凝血酶的识别位点。pGEX-5X-1、pGEX-5X-2和pGEX-5X-3则是pGEX-3X的衍生物，含有Xa因子的识别位点（详见表1）。表1. pGEX载体的蛋白酶切割位点pGEX-2TK设计独特，它通过融合产物的体外直接标记，实现了表
6、达蛋白的检测。此载体含有从心肌中获得的cAMP依赖蛋白激酶的催化亚基的识别位点。蛋白激酶位点位于GST结构域和MCS之间。利用蛋白激酶和-32PATP可直接标记表达的蛋白，用标准的放射测定或放射自显影技术可轻松检测。pGEX-2TK是pGEX-2T的衍生物；它的融合蛋白可用凝血酶来切割。pGEX载体都提供了三种翻译读码框，从EcoRI限制性酶切位点开始。pGEX-1T、pGEX-6P-1、pGEX-4T-1和pGEX-5X-1可直接接受并表达分离自 gt11文库的cDNA片段。索取pGEX载体的更多资料为了补充pGEX载体，目前还有GST载体的测序引物，可立即用于pGEX载体中插入的双链DNA的测序。多种大肠杆菌宿主菌株可用于pGEX载体的克隆和表达。E.coli BL21，一种用于重组蛋白的最优表达的蛋白酶缺陷的冻干大肠杆菌宿主菌株，也可单独购买。（未完，待续）(http:/
