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1、培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。依次比例酌量配置。超净工作台常规配置移液器1套（2.5l、20l、200l、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（502），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200l、10l），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯
2、照射30min后开始实验操作。首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。实验步骤一、原代细胞的培养1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对
3、准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。3. 取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。4. 拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧
4、紧平放，在瓶身做好实验标记。5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。6. 将培养瓶放于28,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。二、 培养液的更换1 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。2 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消
5、毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，4 拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放。5 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精
6、灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。6. 将培养瓶放于28,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代。三、 细胞传代1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。2. 将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧
7、。3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。4. 将培养瓶平放使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计时约40s，立马竖起对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机。若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，则需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s后迅速竖起对着灯光观察细胞情况，可反复几次，
8、直至出现针孔样缝隙和1-2个细胞脱落的最佳消化状态。用移液器将胰酶吸净。5. 吸取1ml培养基于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。6. 取2或3个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，然后将细胞培养基均匀的分到3或4个培养瓶内（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传3或1传4的培养。7. 拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，
9、悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基悬空移入每个培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。8. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。9. 将培养瓶放于28,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株。四、 细胞株的保存1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。2. 将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净
10、后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。4. 将培养使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，计时约40s，立马竖起对着灯光可观察到细
11、胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机。若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，则需继续消化，轻轻的迅速平放培养瓶使胰酶浸没细胞层1s后迅速竖起对着灯光观察细胞情况，可反复几次，直至出现针孔样缝隙和1-2个细胞脱落的最佳消化状态。用移液器将胰酶吸净。5. 吸取1ml细胞冻存液于培养瓶内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。6. 将1ml含有细胞的冻存液移入新的保种管内，拧紧瓶盖，做好实验标记。7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后
12、拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。8. 将保种管先放于4冰箱 30min后拿出放置-20冰箱过夜，次日再放于-80的冰箱内3-4天，最后存放于-196的液氮灌内长期保存。注此过程也可简化因实际操作过程中经验所得：步骤7结束后将保种管用干脱脂棉包裹后胶带封好直接放于-80冰箱内4-5天，即可放于液氮灌保存。但-80冰箱也可保存细胞株2-3月。五、 细胞转染操作前：紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。1. 预混液A fugeneHD 5ul/孔 + OPTI-MEM 45ul/孔 室温温育10min2. 预混液B ar
13、r 16ul/孔 + OPTI-MEM 34ul/孔 室温温育5min3. 预混液C 空载 16ul/孔 + OPTI-MEM 34ul/孔 室温温育5min4. 预混液D arr 12ul/孔 + ops 12ul/孔 + OPTI-MEM 26ul/孔室温温育5min注：fugeneHD为转染试剂 ，arr，空载，ops为模板？OPTI-MEM为空培养基5. 将步骤2,3,4中的预混液B,C,D中分别加入步骤1中的等体积的预混液A，轻柔混匀，室温温育15min，再次轻柔混匀后室温温育15min。6. 取出6孔培养板，将每培养孔的培养基全部吸净，无残留，是为了防止残留的双抗和胎牛血清影响转染效果。加入1.5-2.0ml/孔的OPTI-MEM 到6孔培养板内，轻轻摇匀。7. 将步骤5中再次混匀温育结束的预混液B,C,D,分别以100ul/孔， 加入目的培养孔中（空载，目的质粒，48h 72h），按上下，左右，斜对角的方向轻轻摇匀。8. 28，5%CO2培养箱孵育6-8h后。细胞换液为完全培养基。另外，转染试剂与质粒的比例为5ul：2ug，此时包被效果最佳。一般，细胞培养48h收RNA，72h收蛋白。
