《B-raf基因突变检测试剂盒(PCR-毛细管电泳法)标准化操作流程》由会员分享，可在线阅读，更多相关《B-raf基因突变检测试剂盒(PCR-毛细管电泳法)标准化操作流程（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、B-raf基因突变检测试剂盒(荧光PCR-毛细管电泳法)标准化操作流程1、预期用途 该产品用于定性检测确诊的结直肠癌患者石蜡包埋病理组织切片DNA的B-rafV600E 基因突变。B-raf 基因是一种癌基因， 编码一种丝/ 苏氨酸特异性激酶， 是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。B-raf 基因位于7p34，长约190kb，转录mRNA 长2.5kb，编码783 氨基酸的蛋白，相对分子质量为94000-95000 Da。 研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等
2、均存在不同比例的B-raf 突变，B-raf 突变主要发生在Exon15 上的激活区的第1799 氨基酸上(T 突变为A)，导致编码的氨基酸由谷氨酸变成缬氨酸(V600E)，该突变能使B-raf 激酶活性提高，V600E 突变能模拟T598 和S601 两个位点磷酸化作用，使BRAF 蛋白激活。近来研究表明，对于野生型Kras、但存在B-raf 基因V600E 突变患者，抗EGFR 单抗治疗无效。2010 年版NCCN 结直肠癌临床实践指南中已明确指出“如K-ras 基因无突变时，需检测B-raf 基因突变，如果后者存在V600E突变，则不应该给予抗EGFR 单抗治疗。”2、仪器配置要求 移液
3、器，振荡器，微型离心机，生物安全柜，高速冷冻离心机，定性PCR仪，荧光定量PCR仪（ABI7500，LightCycler 480，MX3000P，CFX-96等），微量紫外分光光度计，基因分析仪（ABI3130，ABI3500DX）。3、 耗材要求 无菌带滤芯吸头、吸水纸，离心管（1.5ml，0.5ml，0.2ml）、PCR反应管（配套荧光定量PCR仪型号）及无粉一次性乳胶手套，基因分析板。4、责任人 基因扩增实验室室长负责技术指导和质量监督。5、 执行人 操作人员应经过专业培训，具有合格的操作技能的检验专业技术人员。6、 检测原理 本产品选取人类基因组B-raf 基因Exon 15 上设计
4、特异性引物和探针，对扩增后的PCR 产物片段进行测序分析。使用尿苷酶(UNG)防污染体系，经加热可以选择性地降解U-DNA，以防止先前PCR 扩增产物的污染。7、 试剂来源 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司8、 样本要求8.1用量：每例标本切5张(10m)白片，连续切片，不漂洗脱蜡，直接封存于1.5ml EP管中；8.2质量：为确保DNA提取成功率，必须选择2年以内的石蜡标本；8.3标本收集方法：石蜡包埋病理切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，为了保证切片组织中含有足够比例的肿瘤细胞，需要加同一组织HE染色片子一张（在显微镜下肿瘤细胞比例70%）。9、 标准操作程序9.1试剂准备（在试剂准备区完成
5、）9.1.1配置说明：检测反应设置阴性质控品和阳性质控品。9.1.2配置过程提前30分钟将试剂取出，室温融化，涡旋振荡10秒，2000 rpm离心15秒待用。确定反应数N，N=待检样本数(n)+质控品数(2)+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下（表2）：试剂B-raf PCR 反应液CB-raf 引物探针混合液纯化水用量(l)12.5N4.5N6N 取1个灭菌离心管配置上述反应体系，试剂全部加入后涡旋振荡10秒，2000 rpm离心15秒。 然后将上述混合液23 L/管分装至PCR反应管中(无菌和RNase-Free)。配完试剂后，充分混合均匀，瞬时离心15sec，放入传递窗。9
6、.2标本制备（标本制备去完成）9.2.1在缓冲间内更换隔离衣，戴上帽子、口罩、手套，将传递窗的试剂取出放入标本制备区的冰箱冷藏，备用。9.2.2从样本盒中取出待检石蜡组织样本，添加1ml二甲苯于样品中，剧烈涡旋10sec。12000rpm离心2min，吸除上清，小心不要吸到沉淀。9.2.3加入1ml无水乙醇于沉淀中，涡旋混匀。12000rpm离心2min，吸除上清，小心不要吸到沉淀。9.2.4打开管盖，室温（15-25）或者37放置10min直至残余的乙醇挥发完全。注意：完全去除残余的乙醇很重要，任何残余的乙醇均会对DNA产生影响。9.2.5重悬沉淀于180ul缓冲液GA中，加入20ul蛋白酶
7、K，彻底涡旋均匀。56水浴1小时（水浴到样本完全裂解为止），再转移到90孵育1小时。9.2.6向离心管中添加200ul缓冲液GB，涡旋均匀。加入200ul无水乙醇，涡旋均匀。再加入200ul无水乙醇，彻底均匀。9.2.7将上述得到的溶液加入吸附柱CR2中（吸附柱放在收集管中），12000rpm离心1min。将离心出的溶液重新加入到吸附柱中，12000rpm再次离心1min，直到所有的溶液通过吸附柱，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。9.2.8向吸附柱中加入500ul缓冲液GD，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。9.2.9向吸附柱中加入500ul漂洗
8、液PW，室温静置2min，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。9.2.10重复步骤15。9.2.11将上步实验所得吸附柱12000rpm离心3min，弃掉收集管及废液，将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，打开吸附柱的盖子置于室温放置数分钟。注意：此步骤目的是使吸附柱中残余的漂洗液挥发干净，漂洗液的残留，可能会影响后续的实验。9.2.12向吸附柱膜的中央滴加20-50ul洗脱缓冲液TB，室温放置2min，12000rpm离心2min，得到DNA溶液。9.2.13加样将B-raf阴性质控品C、已处理样本和B-raf阳性质控品C 分别取2 L加入PCR 反应管
9、中，盖紧管盖，瞬时离心将管壁上的液体全部甩至管底，避免产生气泡，如有气泡产生，轻弹PCR 反应管壁，再次瞬时离心（若仍有气泡重复此步骤），然后立即进行PCR 扩增反应。9.3PCR扩增9.3.1PCR扩增程序设定序号阶段温度时间循环数1UDG酶反应372分钟12预变性953分钟13变性9415秒154退火、延伸、荧光信号采集(FAM荧光)6035秒5变性945秒306退火，延伸702分钟7变性7815 秒8退火，延伸，荧光信号采集(FAM荧光)6045 秒9仪器冷却251 分钟1收集荧光：FAM 通道10、PCR结果分析10.1结果分析条件设定10.1.1 ABI 7500 型荧光定量PCR仪
10、(Version 1.4.0) 反应结束后，根据PCR仪说明书及荧光曲线进行手动或自动调整基线和阈值。手动调整时，基线（Baseline）的起始点（Start）设定在58之间，终止点（Stop）设定在1215之间，阈值线（Threshold）通常设定在10005000之间（视具体情况而定）。设定之后，点击 “Analyze”（分析）按键，即可从“Report”窗口的“Ct”处得到各样本的Ct值。10.1.2 Stratagene Mx3000P型荧光定量PCR仪 反应结束后，根据荧光曲线进行手动或自动调整基线和阈值，手动调整基线（Non-adaptive baseline）的起始点（Start
11、）一般设定为58，终止点（Stop）一般设定为1215，阈值线（Threshold fluorescence）通常设定在5002000之间（视具体情况而定）。设定之后，可以从“Text report”窗口的“Ct(dRn)”处得到各样本的Ct值。10.2质量控制10.2.1B-raf 阴性质控品C：靶基因通道无S 型扩增曲线，Reports 界面Ct 一栏显示Undetermined；10.2.2B-raf 阳性质控品C：靶基因通道有S 型扩增曲线，且15Ct25；以上条件必须在同一次实验中全部满足，否则本次实验结果无效；10.2.3待测样品的Ct32 时，低于本试剂盒测序检测下限，不能进行后
12、续的测序反应，说明加入的DNA 含量不足或含有较多的PCR 抑制物，应重新提取DNA 或调整DNA 加样量，必须使待测样品的Ct32，才能满足后续实验要求；10.2.4若检测靶基因通道无S 型扩增曲线，Reports 界面Ct 一栏显示Undetermined，则样本提取无DNA，为阴性，建议重新提取；10.3反应完毕，存储PCR结果以便进行数据分析，PCR产物用于后续实验。11、PCR产物的酶解对样本DNA 含量(Ct32) PCR 产物和B-raf 阳性质控品C 分别取5 L于PCR反应管中，再分别加入2 L SAP酶混合液涡旋振荡10秒，2000 rpm离心15秒，于PCR仪上进行酶解。
13、酶解程序如下：37 60分钟，80 15分钟。12、基因分析PCR反应分别取样本和B-raf 阳性质控品C 酶解产物3 L、测序试剂1 L和B-raf 测序引物2 L进行PCR 扩增，具体条件。序号阶段温度时间循环数1预变性961分钟12变性9610秒253退火505秒4延伸602分钟5仪器冷却251分钟113、基因分析产物纯化0.2 ml离心管中13.1.在每孔内加入16 L醋酸钠-乙醇混合物(3M NaAc:无水乙醇=1:15)，剧烈振荡，避光静置15分钟 12000 g以上4 离心30分钟，吸弃上层液体；13.2.加入70 L 70%预冷乙醇，剧烈振荡，12000 g以上4 离心15分钟
14、，吸取上层液体；13.3.让酒精在室温挥发干净，加入12 L Hi-Di Formamide溶解DNA；13.4.在PCR仪上变性：95 4分钟，4 4分钟，上机电泳；在自动化的基因分析仪上进行分析，若不能当日基因分析，可置-20保存。14、 检测结果分析 采用测序分析软件Chromas 对结果进行分析：14.1.用Chromas 软件打开测序结果，在Edit 菜单下点击“Reverse+Complement”；14.2.删除不稳定测序区域；14.3.在Find 下，找到序列GGAGCT，移动光标至“G”左侧的第一个碱基，按快捷键Alt+L 选中测序前段不稳定区域，在Edit 菜单下点击“De
15、lete Cutoff Sequences”删除以上区域；14.4.按快捷键Ctrl+1，显示氨基酸序列，将其后面的序列与下面的野生型标准序列比对，标记处600(T1799A)位密码子GTG 可能会发生TA的突变（参考突变判读依据）。野生型核苷酸TTT GGT CTA GCT ACA GTG AAA TCT野生型氨基酸F G L A T V K S突变型核苷酸TTT GGT CTA GCT ACA GAG AAA TCT突变型氨基酸F G L A T E K S突变判读依据： 杂合峰：如果在一个特定的位点上出现了两种颜色的峰叠在一起即为杂合峰。在毛细管电泳时，这些测序图的峰高代表荧光强度，一种荧光素的高度能在一定程度上代表某一特定片段的量。临床取得的肿瘤组织一
