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1、Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome,www.sciencexpress.org / 20 May 2010 / Page 1 / 10.1126/science.1190719,最新突破： 我们成为上帝！,第八章 RNA转录后的剪接与加工,a)原核生物,b)真核生物,细胞核,前体mRNA,加工：5加帽，3加尾，内含子切除,多肽合成,细胞质,一、RNA转录后的剪接、加工与修饰概述 二、原核生物RNA的转录后加工 三、真核生物RNA 的转录后加工,RNA的类型和功能,Small cyt
2、oplasmic RNA,Small nuclear RNA,heterogeneous nuclear RNA,rRNA和tRNA：不论原核或真核生物的rRNA和tRNA都是以初级转录本形式被合成的，然后再加工成为成熟的RNA分子。 mRNA：,原核生物的mRNA却不需加工，仍为初级转录本的形式。 真核生物pre-mRNA要经过复杂的加工历程，包括加帽、 加尾和内含子的剪接等。,RNA的加工,一、RNA转录后的剪接、加工与修饰概述 二、原核生物RNA的转录后加工 三、真核生物RNA 的转录后加工,在翻译过程中参与蛋白质合成的tRNA和rRNA都不是最初的转录产物，这是由于： 它们的5端都是单
3、磷酸，而原始的转录产物5端应是三磷酸 分子比初始转录物小； tRNA含有特殊的碱基，这些碱基只有通过一些化学修饰才可 以产生。,基因工程上，就是根据这一点，使用一种5单磷酸特异性的RNA外切酶从原核生物total RNA抽提物中分离mRNA(5有3个磷酸)的。,（一）原核生物rRNA前体的加工,E.coli共有7个不同的rRNA操纵子（ rrnA-rrnG） 分散分布在整个基因组上 每个操纵子的原初转录物为30S(约6500bp)前体分子，5端为pppA 每个操纵子的原初转录物含有一个拷贝的 5S,16S 和 23S rRNA, 以及一些tRNA序列。 tRNA在rrn上的数量、种类和位置都不
4、固定。 转录与加工同时进行,P30,RNase识别特定的茎环结构，交错2bp切割，产生P16和P23 5S rRNA前体P5是在RNaseE作用下产生的，它可识别P5两端形成的茎环结构 P5、P16和P23两端 的多余附加序列需进一步由核酸酶切除。不同细菌rRNA前体的加工过程并不完全相同，但基本过程类似。,（二）原核生物tRNA前体的加工 E.coli基因组有tRNA基因约60个 tRNA基因大多成簇存在（串联的tRNA可能相同，也可能不 同），或与rRNA基因或蛋白质基因组成混合转录单位. 单顺反子（不常见）,三种tRNA前体分子,到目前为止了解的最清楚的是E.coli的tRNA1Tyr（
5、连续两个组成一个多顺反子RNA）,3修剪：RNaseD能够识别CCA末端序列，1个1个的切除7个核苷酸。 5切断：内切核酸酶RNaseP在箭头所指处切断。 暴露或添加CCA：RNaseD除去3末端二个核苷酸 核苷酸修饰和异构化：有6个碱基通过专一性的酶过程变为异常碱基。,3切断：一种能识别发夹结构的内切核酸酶在箭头所指处切断,RNaseP 是一种核酶 （Ribozyme）,RNaseP 是一种内切核酸酶， 由一个RNA分子（M1 RNA）和一个蛋白质分子组成，是一种简单的RNP,其中的RNA分子可以独立行使核酸内切酶功能，因此是一种催化性RNA分子（核酶） RNaseP 存在于原核生物和真核生
6、物。 RNaseP负责原核生物所有tRNA 5端加工,RNaseD：它能从RNA的3端一个一个地切去碱基，以产生tRNA的真正的3端(5端由RNaseP产生)。 RNase：有外切核酸酶的活性，它能够将tRNA完全分解完。以前认为它也与tRNA加工有关，但目前认为它可能仅和RNA的分解代谢有关。,1978年，Altman在纯化RNaseP时，发现一种377个核苷酸长的RNA片段与一种1.4KD的蛋白质总是同时被纯化，另外，还发现RNaseA及小球菌核酸酶都可使RNaseP失活，RNaseP的浮力密度显示RNA蛋白质复合物特性，在离体条件下，大肠杆菌RNaseP的RNA亚基与蛋白质亚基都不表现R
7、Nase活性，但若把RNA亚基与蛋白质亚基进行重组，则重组复合物具有RNA酶活性。更进一步的研究发现，RNaseP的RNA亚基可在高Mg2+浓度下，催化前体tRNA的剪切，而蛋白质亚基则无此功能，从而说明RNaseP的催化功能是由其RNA亚基部分来承担的。,1989年的诺贝尔化学奖,核酶,Crystal structure of RNase P with substrate tRNA (green),3 端加上CCA 在细菌中有两种tRNA前体，其区别在于其3端的序列。,型分子： 有CCA三联体在其3端。 型分子： 某些噬菌体编码的tRNA没有CCA序列。当其他碱基被一个一个从前体分子上除去后
8、，另由称为tRNA核苷酸转移酶的将CCA加到3端上去。 核生物中可能所有的tRNA前体都属于型，在成熟时都需要通过酶的作用，在其3端加上CCA序列。,碱基修饰: 甲基化酶、硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等等,（三）原核生物mRNA前体的加工,mRNA大多不需要加工，一经转录即可直接进行翻译 但也有少数多顺反子mRNA需通过核酸内切酶切成较小的单位，然后再进行翻译。 例如，核糖体大亚基蛋白L10和L7L12与RNA聚合酶和亚基的基因组成混合操纵子，转录出多顺反子mRNA后需经RNaseIII将核糖体蛋白质与聚合酶亚基的mRNA切开，然后再各自进行翻译。细胞内RNA聚合酶的翻译水平远低于核糖体蛋白的翻译
9、水平，将两者切开，有利于各自的翻译的调控。,类似的加工过程也可以在某些噬菌体的多顺反子mRNA中见到。例如，大肠杆菌噬菌体T7的早期基因转录出一条长的多顺反子mRNA，经RNaseIII切割成5个单独的mRNA和一段5端前导序列。mRNA的切割对其中某些早期蛋白质的合成是必要的。推测可能是由于较长的mRNA产生二级结构，会阻止有关编码序列的翻译。这种RNA二级结构（可能还有三级结构）与其功能的调控关系在多种情况下均可看到，并不仅限于翻译起始的调控。通过RNA链的裂解，改变了RNA的二级结构，从而影响它的功能。,一、RNA转录后的剪接、加工与修饰概述 二、原核生物RNA的转录后加工 三、真核生物
10、RNA 的转录后加工,(一)真核生物rRNA的加工,4种rRNA：5.8S，18S，28S和5S rRNA。前三者的基因组成一个转录元，产生45S的前体RNA。 近年来发现，哺乳动物的原始转录本并不是45S，是47S。由于3端部分很快进行转录处理，5端也除掉一小部分故变为45S。,rDNA重复单位,rDNA转录单位,真核生物rRNA基因（rDNA）的组织,NTS: nontranscribed spacer 不转录的间隔区 ETS: external transcribed spacer 外部转录间隔序列 ITS: internal transcribed spacer 内部转录间隔序列,真核
11、生物rRNA的加工过程比较缓慢，中间产物可以分离，因此加工过程比较清楚。 哺乳动物45S RNA的加工有几种不同方式。例如，人类45S RNA与小鼠的45S RNA加工方式就不相同。 RNaseIII和其他RNA酶在前体加工中发挥重要作用,哺乳动物45S rRNA前体的转录后处理,rRNA前体剪切位点的识别： 核仁小分子RNA(snoRNA)形成的snoRNP参与RNase 对特定立体结构和剪切位点的识别, 也参与甲基化修饰位点的识别 RNA前体分子的甲基化帮助识别,前体rRNA分子中的某些碱基进行甲基化修饰，甲基化的主要部位在核糖第二位的羟基上，在甲基化的过程中需要snoRNA的参与。甲基化
12、可能对加工起引导作用。实验证明前体rRNA中被甲基化的部位在加工过程中并未被切除，而是一直保持到成熟的rRNA中。另外还发现，如果人为地阻断前体rRNA的甲基化，前体rRNA的成熟加工也被阻断，因此，推测前体rRNA的甲基化对rRNA的加工具有指导作用。,5S rRNA的基因含120bp，处在另一个转录单位中，这个单位含有120bp的转录区和600bp的非转录片段 5S rRNA由RNA聚合酶转录。,爪蟾5S rRNA的基因结构,（二）真核生物tRNA的加工,真核tRNA的基因和原核不同 真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区 真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得
13、多，如酵母约有400个tRNA基因 5端单磷酸核苷酸，表明已被加工过 tRNA的前体分子中含有内含子。,tRNA的加工分成3个阶段： 5剪裁，3剪裁 切除内含子 3末端用tRNA核酸转移酶加-CCA 修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰,4-硫尿苷,次黄嘌呤核苷（肌苷）,1-甲基鸟苷,N6 -异戊烯基腺苷,假尿嘧啶核苷,二氢尿苷,真核tRNA内含子的特点：,位置相同，都在反密码子环的下游，内含子和反密码子配对形成茎环 外显子和内含子交界处无保守序列 不同tRNA的内含子长度和序列各异 内含子的剪切是依靠RNA酶异体催化（自身不是核酶）,1.5端加帽 2.3端加尾 3.RNA的
14、剪接 4.修饰 5.RNA的编辑,真核生物mRNA前体称为hnRNA，又称类似DNA的RNA(D-RNA)。由hnRNA加工为成熟的mRNA，经历以下过程：,(三)真核生物mRNA的加工,1、在5端加帽（cap）,m7Gppp,鸟甘酸转移酶,场所是核内,帽子0：m7 G ppp X 单细胞生物（如酵母） 帽子1：m7 G ppp Xm 多细胞生物，主要形式 帽子2：m7 G ppp XmpYm 占10-15%,三种帽子的共同位置,在帽子1中可被甲基化,帽子1,帽子2,剪接前加帽，剪接后加帽,加帽酶的征集（recruitment）由RNA聚合酶CTD尾巴及其磷酸化状态完成，征集后转移到RNA上需
15、要加工位点。 加帽因子的征集需要Ser5磷酸化 加帽发生在RNA只转录出20-40nt 时转录起始和延伸转换时刻 加帽后Ser5的去磷酸化导致加帽machinary的释放。,场所是核内,剪接前加帽,剪接前加帽：(含有最初的5端三个磷酸，转录第一个通常是A或G),如呼肠病毒， 牛豆病毒,去掉一个mRNA5端磷酸，留下两个末端磷酸（RNA末端磷酸酶） 5端加上GTP (鸟苷转移酶guanylyl transferase), 去掉GTP的两个磷酸，形成5-5三磷酸连接 鸟嘌呤第七位N原子甲基化 (甲基转移酶，甲基供体是S-腺苷甲硫氨酸SAM).,剪切后加帽,如疱疹病毒和口炎病毒,帽子结构功能： 有帽
16、子结合蛋白（CBP）与帽子结合： (1)有助于mRNA运输越过核膜，进入胞质； (2)保护5不被酶降解； (3)翻译时供eIF（起始因子）和核糖体识别。 （4）促进5端内含子的剪切,或称为RNA末端腺苷酸转移酶，Poly(A)聚合酶,大约200bp,2、3端加尾,（多聚腺苷酸polyA尾巴）,加尾信号AAUAAA,具体机制,机制控制PolyA长度,CPSF:cleavage polyadenylation specificity factor. CstF: cleavage stimulation factor. PAP:polyA polymerase CF: factor(s) required for cleavage,多聚腺苷酸尾巴功能： 有蛋白质（PBP）与PolyA尾结合，提高了mRNA在细胞质中的稳定性。 增强翻译的效率,4. 修饰,原核生物mRNA分子中不含有稀有碱基，但真核生
