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1、Stober 法合成作为生物分析的单分散荧光二氧化硅纳米微粒Stober Synthesis of Monodispersed Luminescent Silica Nanoparticles for Bioanalytical AssaysLiane M. Rossi, Lifang Shi,Frank H. Quina, and Zeev Rosenzweig化学系和先进材料研究所（AMRI） ，新奥尔良大学，新奥尔良，路易斯安那州70148,及化学研究所，圣保罗大学，圣保罗，SP 05508-900 巴西2005 年 2 月 15 日收到，最后形态： 2005 年 3 月 7 日我们发现
2、一种简单的方法可制备出高产率的不同尺寸、粒度分布窄的发光、耐光的硅纳米微粒。该方法是基于使用 Stober 合成的荧光团形成了感光的二氧化硅纳米粒。不同于常用的制备发光硅微粒的微乳法，Stober 法是在一种在室温下碱性乙醇、水混合条件下，可避免使用有毒的有机溶剂和表面活性剂。我们的发光颗粒包含着过渡金属化合物：三（1,10-菲咯啉）二氯化钌，Ru(phen)3Cl2。与 Ru(phen)3溶液相比，它有较高的光稳定性和较长的荧光寿命。染料分子从硅球泄露是微不可计的，这归因于带正电的钌化合物和带负电的硅球之间强静电吸引力。为了证明高度发光的硅纳米球在生物分析中的适用，我们在其表面修饰抗生蛋白链
3、菌素并将其结合在生物素化的载玻片上。实验数据显示，在涉及生物分析中模拟发光检测法中荧光纳米硅球有着吸引人的可供选择的检测技术。简介近年来发光纳米球被用于替代有机荧光团做为生物体系的光标记物。它相对其他染料有更多的优势。 【1,2】 例如，由于发光分子在纳米球包裹内隔离了可使发光猝灭的因素，如氧气和水，增加了耐光度和发射量子产率。 【3,4】 由于较易功能化的粒子表面，硅纳米微球是一个非常有吸引力的本体，这使它可结合生物活性分子形成靶向目标。 【1-10】 当有机荧光团与粒子共价，他们合成涉及染料的预先修饰. 【5，11】 最近，Trau 和他的同事采用 Stober 法合成了多孔化功能性二氧化
4、硅微球。 【12】 随着氨 丙 基 三 乙 氧 基 硅 烷 加 入 与 异 硫 氰 酸 修 饰 的 染 料偶 联 ， 荧 光 分 子 逐 渐 被 包 含 在 微 球 内 。 然 而 ， 大 多 数 染 料 分 子 在 不 影 响 他们 的 发 光 特 性 下 不 容 易 被 修 饰 。 有 机 荧 光 团 能 包 裹 在 二 氧 化 硅 微 球 里 ， 但 这被 证 实 是 困 难 的 ， 因 为 二 氧 化 硅 本 体 是 高 亲 水 性 的 而 染 料 分 子 有 相 对 较 高 的疏 水 性 。Stober 合 成 是 制 备 二 氧 化 硅 微 球 的 广 泛 应 用 的 方 法 。
5、【 13】 这 个 简 单 的一 步 合 成 是 正 硅 酸 乙 酯 （ TEOS） 在 乙 醇 -水 碱 性 条 件 混 合 室 温 下 缩 聚 而 成 。采 用 Stober 法 可 以 得 到 优 良 的 控 制 尺 寸 、 窄 的 尺 寸 分 布 和 平 整 的 球 面 的 二 氧化 硅 微 粒 。 我 们 的 研 究 集 中 在 用 Stober 制 得 中间密封着钌二亚胺配合物的二氧化硅纳米粒子及其在生物链霉亲和素的亲和力测定的应用。实验方法药品与试剂。三（1,10-菲咯啉）二氯化钌、TEOS、 3-巯基丙基三甲氧硅烷（MPTMS）均购于 Aldrich Chemicals 公司。
6、链霉亲和素 -马来酰亚胺和生物素-马来酰亚胺购于 Sigma。所有试剂都是用原样除非特别提到。去离子水至少有 18Mcm 的特定电阻率，用来配置所有的磷酸缓冲溶液。荧光硅球的制备：往 5mL 的 TEOS-乙醇溶液添加含有氢氧化铵和三（1,10-菲咯啉）二氯化钌水溶液的 25mL 乙醇混合液。试剂的用量如表 1。混合液搅拌一个小时后超声十分钟。 离心（5000rpm，10min ）分离出荧光纳米粒再用乙醇洗涤三次。样品 100减压干燥 1 小时。制备的产率大约为 80%。表 1 制备荧光二氧化硅纳米微球各个药品量修饰硫醇的的发光硅球的制备。2mg 发光硅球超声溶解于 10mL 乙醇，加入100
7、L MPTMS，密闭搅拌过夜。离心分离（5000rpm ，10min）出微球，乙醇洗涤三次。将微球分散在 4mL pH7.4 的磷酸缓冲液，4下保存。修饰抗生蛋白链菌素的发光硅球的制备。pH7.4 的 5mL 磷酸缓冲液中加入0.25mg 马来酰亚胺标志的抗生蛋白链菌酶，与储存的 1mL 硫醇修饰的发光硅球混合，室温下缓慢搅拌 2h。离心分离（5000rpm，10min），磷酸缓冲液洗涤三次后分散于 4mL pH7.4 的磷酸缓冲液，立即用于生物素链分析。修饰生物素的玻片的制备。1M HNO3溶液洗涤显微镜玻片，分别在水和乙醇超声 15min 除去沉淀的有机物质。干燥的氮气吹干载玻片，室温下在
8、 5% MPTMS的甲苯溶液中放置 4h。用甲苯、乙醇洗涤后通干燥的氮气吹干，100下 16h。然后取 0.5mg 马来酰亚胺标志的生物素溶于 10mL 的 pH7.4 磷酸缓冲液，室温下浸入已处理好的载玻片 2h。用磷酸缓冲液洗涤此生物素标志的载玻片，用于生物素链分析。连接修饰抗生蛋白链菌酶的发光硅球和修饰生物素的玻片。取 100L 的浓度范围在 0-200g/mL 的抗生蛋白链霉菌修饰的发光硅球溶液平铺在生物素修饰的载玻片上，等待 30min 后用水洗三次，用数码影像显微镜系统测量荧光颗粒附着在玻片上的点数。荧光硅球的表征。JEOL-2010 电子显微镜测微粒的透射电镜（TEM）图像，条件
9、是 200kV 的加速电压。滴一滴微粒水溶液在铜载网作为 TEM 样品，在任意位置放大的图片可发现粒度分布大约在 200 粒。用石英比色皿在 PTI 主量子荧光分析仪扫描荧光发射，以 75w 的短弧氙灯做光源。爱丁堡分析仪 LP900 激光闪光系统用发射模式测量荧光寿命（监控灯快门关闭）。取 3.00mL 钌染料溶液或 3.00mL 钌掺杂的荧光微粒悬浮液置于 1cm 的石英荧光比色皿。激发光为Surelite I-10 Nd:YAG 激光器发射出的第三谐波（355nm）。必要时通氮气冒泡去养。测量时持续搅拌样品，用常见的紫外-可见吸收光谱（惠普 84452A 二极管阵列分光计）检测激光分解。
10、进行 10 次激光扫描平均出其 590nm 的发射衰减曲线，分析常规标准指数衰减是采用 LP900 爱丁堡分析仪器系统软件获得受激发物质的寿命。图 1. Ru(phen)3Cl2掺杂的 44018nm 的硅球的 TEM 图像（左）和数字荧光图像（右），其为 40 倍显微目镜、用激发滤波器通带为 46010nm 的、505nm 分色镜、515nm 的长通发射滤波器得到。数字荧光成像显微镜系统。采用倒转的荧光显微镜（Olympus IX70）、100w 汞灯作为光源的数字荧光成像显微镜系统获得荧光微粒与生物链霉亲和素修饰的载玻片相互作用得到的荧光影像。荧光影像收集是用激发滤波器通带为46010nm
11、 的 20 倍显微目镜、505nm 分色镜、515nm 的长通发射滤波器的设备。高效 ICCD 相机（罗伯科学，BH2RFLT3 模式）拍摄数字图像。结果与讨论本文描述的是 Stober 法制备强荧光单分散的二氧化硅纳米微粒包埋无机荧光染料 Ru（phen） 3Cl2,平均产率 80%。与微乳液常用的基础方法制备发光二氧化硅微粒不同，这项技术完全避免了使用潜在的有毒的有机溶剂和表面活性剂。进一步共轭微粒和生物分子变得简单些因为不需要洗涤粒子上的表面活性剂，但当微乳液技术用于制备纳米粒通常需要多次的清洗步骤。发光二氧化硅微粒的 TEM 以及数字荧光显微图像如图 1.稍微改变氨与水在反应混合物中的
12、量导致单分散硅球有不同的直径（见表1）。由本来的 Ru（phen） 3溶液的荧光强度减去上清液的荧光强度确定染料装载效率。在我们的实验条件下装载效率大约在 10%。在准备染料溶液浓度分析时二氧化硅微粒要尽可能高的发射量子产量。在二氧化硅纳米微粒和自由的Ru（phen） 3溶液的吸收和发射荧光测量值的基础上可估算发射量子产量。在460nm 的发射下类似的吸收信号的粒子悬浮液与自由的染料相比是双重减少的。在前人研究的基础上可得 Ru(phen)3的发射量子产率在 0.1 左右，我们测量得出的发光纳米微粒的发射量子产率大约在 0.05。粒子的透射电镜图像显示这些粒子是高度的单分散并且呈现出平滑的形状
13、和窄的尺寸分布。能够控制粒子的尺寸是非常有用的，因为不同粒径在不同的应用中都有需要。应当指出的是，使用传统的荧光显微仪测量单个粒子较粒径大于 400nm 的容易。在图 1（右），粒子在信号与背景比例约 100 时出现高度光泽。图 2. 充空气（左）和充氮气（右）的Ru(phen) 3Cl2溶液的时间分解的强度衰减和非特图。其中包含自由染料（曲线 a）、吸附染料的硅球（曲线 b）和用 Stober 法制得的染料掺杂硅球（曲线 c）。在 460nm 激发下，包埋 Ru(phen)3的微粒发出强烈的红光（发射波长590nm），化学稳定性的测量表明，该包埋的分子泄漏率很少，不能使用我们现有的仪器观察到
14、。观察到很小或者无泄漏的原因是带正电荷的 Ru（phen） 3分子与带负电荷的二氧化硅硅球的强静电吸引力。自由染料和荧光纳米颗粒样品耐光性的测量比较采用连续的 1.5kw 的氙灯。测量显示发光的纳米颗粒在相同的照射下，比自由染料多了两倍的耐光性。对新合成的颗粒增加的耐光度归因于氧进入硅球的渗透性差，氧分子往往导致染料光漂白，因为其是引发光分解的单态氧的前体。钌二亚胺化合物如 Ru（phen） 3有用于氧气传感应用。 15，16在不含氧的环境下，氧猝灭效率下降从而这些复合物的发光强度增大。不过，当染料被包埋在我们的硅球里它的作用也仅仅是最低限度地应对外部氧气含量的变化。用 Stober 法制备包
15、埋 Ru（phen） 3的硅球的发光强度在充满氧的溶液与相同的颗粒在饱和 N2 中相对比，只减少了 30%。与此相反，用染料装进事先准备好的二氧化硅颗粒（物理吸附）的方法制备的微粒发光强度下降 65%，而自由染料的发光强度下降了约 80%。从测量发光寿命确定了 Ru（phen） 3被包埋在硅球的发光性能的影响。详见实验部分。图 2 描述了（a）水溶液中自由Ru（phen） 3、（b）由填充 Ru（phen） 3至事先制好的硅球方法制得的发光微粒、（c）Stober 法制得的发光微粒三种样品在充空气溶液（左）以及充氮溶液（右）条件下的发光寿命。在充气的的溶液中，自由染料的发光寿命是530 12
16、ns,染料装载制备的发光微粒的发光寿命是 990 45 ns，Stober 法制 备的发光微粒的发光寿命是 1357 86 ns。在含氮溶液中自由染料的发光寿命增加到 99811 ns（曲线 a）。染料装载制备的粒子的发光寿命是 127385 ns（曲线 b）,比其在充满了空气的条件下的发光寿命高了 25%，这表明，相对的连接到粒子表面的分子数大于被包埋在粒子里面。这些分子的发光都受到样品中氧浓度的改变的影响。相比之下，采用 Stober 法包埋 Ru（phen） 3的荧光寿命只增至 1445108 ns，对于其在充满空气条件下的发光寿命增幅仅 6%（曲线 c）。应该指出的是，这些发光寿命有近似价值，因为衰减曲线，尤其是染料掺杂的粒子的衰减曲线，呈现出一阶指数的衰减变化。这些变化是归因于不同量的氧对包埋在硅球内染料分子的影响。然而，可以合理的得出结论：用 Stober法制备的发光微球比由染料装入预先做好的粒子里面更能保护染料分子不受光致漂白和氧猝灭。如前面提到的，我们也成功地通过水解和缩合作
