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1、1、 验证方案的起草起草人部门日期2、 验证方案的审批审核人部门日期3、 验证方案的批准批准人批准日期目 录1 前言2 职责3 验证的方法及步骤4 异常情况及偏差处理5. 验证结果评价及建议6、再验证周期1. 前言消毒剂主要使用在洁净控制区域，用于控制生产环境、设备表面等的微生物污染的一种化学剂。由于没有一种消毒剂是完全理想的，因此有必要在实际工作中使用两种以上的消毒剂。交替使用在理论上有利于防止形成相同环境的分离菌或抑制细菌的适应性。本实验方案针对75%乙醇、1%新洁尔灭、3%甲酚皂杀菌剂、3%的过氧化氢溶液共4种消毒剂进行抑制或者杀灭微生物的效果确认。1.1验证的目的本验证的目的在于制定方
2、法及可接受标准，来评价消毒剂对微生物的杀灭效果。1.3验证的范围75%乙醇、1%新洁尔灭、3%甲酚皂溶液、3%的H2O21.4验证内容： 本验证先在实验室对所使用的消毒剂，用六种控制菌做生物指示剂挑战性实验；然后做现场消毒考察实验，即现场消毒后用棉签取样法对消毒后的表面取样，做表面残留微生物限度检查。通过对指示菌的杀灭对数值和现场消毒后洁净区表面微生物的残留限度来确认消毒剂的消毒效果。2. 职责2.1验证小组成员：部 门人员2.2职责2.3验证进度3. 验证方法及步骤3.1实验材料3.3.1 菌株 （1）细菌：金黄色葡萄球菌 (ATCC6538)铜绿假单胞菌(ATCC15442)大肠杆菌(AT
3、CC25922) 伤寒杆菌(ATCC6539)（2）细菌芽孢：枯草杆菌芽孢(ATCC9372)（3）真菌：白色念珠菌(ATCC10231)3.3.2 培养基无菌大豆胰蛋白胨琼脂培养基(TSA)、营养肉汤培养基。3.3.3 稀释液：1%蛋白胨-0.03mol/L PBS 溶液 3.3.4 中和剂：0.1%卵磷脂+1%吐温 80 溶液； 0. 5%硫代硫酸钠（3%过氧化氢） 3.3.5 无菌试管 3.3.6 无菌平皿(90mm) 3.3.7消毒剂：75%乙醇、1%新洁尔灭、3%甲酚皂溶液、3%的H2O23.3.8移液器及配套无菌吸头:0-100ul，100-1000ul3.2中和剂效力确认中和剂效
4、力及毒性试验目的在化学消毒试验中，达到规定消毒时间终点时，要求立即终止残留消毒剂的继续作用，以便准确检测出消毒体系中残留存活的微生物及其数量。因为消毒体系中残留的消毒剂，可能对微生物的生长繁殖具有一定抑制作用，从而可导致对杀菌效果偏高的错误判断，甚至产生假阴性结果。残留消毒剂的去除，可排除残留消毒剂对微生物的抑制，从而使试验获得正确结果。中和法是指在消毒剂与微生物作用到达规定时间的终点时，取样加于适宜种类和浓度的中和剂中，将残留消毒剂迅速中和，使其不再持续抑制或杀灭微生物的方法。本试验中所使用的中和剂必须既能有效抑制消毒剂的杀菌性（中和剂的效力试验）同时又不削弱微生物活力的恢复（中和剂的毒性试
5、验）。中和剂效力、毒性确认用稀释剂将试验菌制成51055106cfu/ml的的菌悬液备用。准备无菌试管6支，按表一试验操作步骤表分组进行操作。各组试昝充分震荡放置于振荡器震荡至少20秒或在手掌上振敲80次，然后移取Iml混合液到平皿中做平皿计数，轻轻转动平皿以使菌落在培养基表面均匀分散开来，每组做两皿平皿，并做好标记。平皿在层流台下吹干，倒置于37下培养48小时后计数。具体结果见附件一中和剂中和效力评估测试记录矮化砧嫁接的苹果树树冠体积小于乔化砧嫁接的苹果树树冠体积，矮化砧苹果树单株产量低于乔化砧苹果树，所以，栽植矮化苹果树必须根据不同的矮化砧木和不同类型的短枝型品种适当加大栽培密度23表一
6、中和剂效力、毒性确认试验操作步骤及结果判断分组试验操作试验目的试验结果判断A4.5ml消毒剂+0.5ml菌悬液作用10min 取0.5ml作用液 4.5ml稀释液试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。应无试验菌生长或极少数菌落生长B4.5ml消毒剂+0.5ml菌悬液作用10min 取0.5ml作用液 4.5ml中和剂试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。观察残留消毒液被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。B组菌落数比C、D、E组少，并符合下列要求：A组平均菌落数 B组平均菌落数05X(110)X+5Y(10)Y+0
7、.5YC4.5ml中和剂+0.5ml菌悬液 作用10min取0.5ml作用液 4.5ml中和剂试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。观察中和剂是否抑菌。D4.5ml中和产物液+0.5ml菌悬液 作用10min取0.5ml作用液 4.5ml中和剂试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。E4.5ml稀释液+0.5ml菌悬液 作用10min 取0.5ml作用液 4.5ml稀释液试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。作为菌数对照F分别吸取1ml中和剂和1ml灭菌0.9%氯化钠溶液于平皿中
8、做活菌计数。作阴性对照应无菌落生长备注若菌落太多不能计数，则移取1ml上述混合物，到9ml灭菌注射的生理盐水中（稀释10倍），充分振荡后再移取1ml做平皿计数。试验结果符合上述所有条件，所测中和剂才可判为合格。3.3消毒剂杀菌效率确认（定量悬浮试验）。3.3.1 原理 将定量的细菌悬液加入消毒剂溶液中，作用一定时间。去除残留的消毒剂影响后，以上液定量接种于营养琼脂平板上。经培养后计算其菌落数。与未经消毒剂作用的对照菌液平板计数相比较，计算出杀菌效率。3.3.2菌悬液的制备用第三代的菌悬液按1：10用9ml的稀释剂稀释5次，计数培养，大约70-80之间，以获得10-4-10-6数量级的菌悬液。将
9、最终稀释的10-4、10-5、10-6三个数量级，即三个稀释梯度的菌悬液，各取2份1ml均匀接种涂布在培养基平板上进行培养计数。将涂布的6块平板在37进行培养，7天后进行读数，以确认稀释浓度。3.3.3试验方法：4.5ml消毒剂+0.5ml菌悬液，作用10min， 取0.5ml作用液 ， 加到4.5ml中和剂试管中混匀，吸取1ml最终作用液于平皿中，做活菌计数。白色念珠菌2328培养72 h后计数，其它菌液3035培养48 h后计数。记录每个梯度1.0ml样品的菌落数（a1,a2），a和a1的平均值都应处于30-300CFU之间。记录结果见附件二3.3.4阳性对照：用稀释剂代替消毒剂，进行平行
10、试验，作为阳性对照。计算每一种挑战菌种的Log下降值，并记下消毒剂的浓度和各自的接触时间。3.3.5杀灭对数值计算 杀灭对数值（KL）对照组平均活菌浓度对数值-试验组活菌浓度对数值3.3.6判定标准 消毒剂对挑战菌的杀灭对数值3 判为合格。3.3.7结论根据实验结果进行计算，如果计算结果符合接受标准，即在一定的接触时间内，消毒剂能够使挑战菌水平下降99.9%（下降3个对数单位），则表明消毒剂能够进行日常消毒使用3.4消毒剂的消毒效果现场考察消毒剂对物体表面消毒模拟现场鉴定试验3.4.1采样计划汇总表试验位置 试验采样时间及频率风险分析 分装机台面消毒前、后，同一平面不同采样点分别进行3次为保证
11、消毒剂的效果，消毒前试验应在洁净室及设备运行之后，人员活动频繁，设备及洁净室墙面等最脏的时候进行消毒前的采样。 分装间墙面分装间地面 3.4.2试验操作程序 (1)随机取物体表而（设备表面、台面、门等），用规格板标定2块面积各为25cm2的区块，一供消毒前采样，一供消毒后采样。 (2)消毒前，将无菌棉拭于含5ml中和剂试管中沾湿，对一区块涂抹采样，横竖往返各8次。采样后，将棉拭采样端剪入原中和剂试管内，漩涡混合仪震荡20s或振打80次，作为消毒前样本。 (3)将配置好的消毒剂喷雾或涂擦于物体表面，保持湿润10分钟进行消毒。消毒后，将无菌棉签拭于中和剂试管中沾湿，并于试管壁上挤干后，对消毒区块涂
12、抹采样，横竖往返各8次。采样后，以无菌操作方式将棉签拭采样端剪入原中和剂试管内，漩涡混合仪震荡20s或振打80次，作为消毒组样本。擦拭法取样示意图 (4)试验结束后，将用过的同批次中和剂各1.Oml接种培养基，作为阴性对照组样本。每份吸取1Oml，以琼脂倾注法接种平皿，每个样本接种2个平皿，放37恒温箱中培养48h，观察最终结果。 (5)计算杀灭对数值。 杀灭对数值N=lg消毒前平均菌落数 -lg消毒后平均菌落数。(6)判定标准 消毒剂杀灭对数值3 判为合格。(7)结论根据实验结果进行计算，如果计算结果符合接受标准，即在一定的接触时间内，消毒剂能够使菌落数水平下降99.9%（下降3个对数单位）
13、，则表明消毒剂能够进行日常消毒使用4 异常情况及偏差处理4.1异常情况处理程序4.1.1日常监测过程中，应严格按照消毒标准操作程序进行操作。4.2偏差或变更说明验证过程中的偏差和异常必须详细记录和说明，并经过调查分析和处理。5. 验证结果评价及建议质量保证部负责收集各项验证、试验结果记录，根据验证、试验结果起草验证报告，报验证领导小组核对。验证领导小组对验证结果进行综合评审，做出验证结论，发放验证证书，确认该再验证周期。对验证结果的评审应包括：5.1验证试验是否有遗漏。5.2验证实施过程中对验证方案有无修改，修改原因、依据以及是否经过批准。5.3验证记录是否完整。5.4验证试验结果是否符合标准
14、要求，偏差及对偏差的说明是否合理，是否需要进一步补充试验。6、再验证周期6.1质量保证部根据验证结果确定再验证周期。6.2当环境监控的结果出现偏差时，应重新评估目前使用的消毒剂，必要时更换消毒剂的品种以及调整消毒剂的使用周期。新消毒剂使用前均需经效果验证后方可使用。附件一中和剂中和效力评估测试记录1.1.工作菌液为金黄色葡萄球菌时，中和剂鉴定试验结果序号项目类型菌落计数结果（ CFU/ml）75%乙醇溶液1%新洁尔灭溶液3%甲酚皂溶液3%的过氧化氢溶液中和剂：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和剂：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和剂：1%卵磷脂 +0.1%聚山梨酯80中和剂：0.5%硫代硫酸钠1（消毒剂+工作菌液)+稀释液2(消毒剂+工作菌液)+中和剂3中和剂+工作菌液4(消毒剂+中和剂)+工作菌液5阳性对照组6第3、4、5组间误差率可接受标准l 第1组无菌生长，或仅有少数试验菌菌落生长；l 第2组菌落数比第1组菌落数多，但比第3、4、
