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1、脱落酸项目报告一、 概述脱落酸（Abscisic acid，简称ABA）是以异成二烯为基本单位的倍半萜竣酸，化学名称为5-（1-羟基-2，6，6-三甲基-4-氧代-2-环己烯-1-基）-3-甲基-2-顺-4-反-戊二烯酸，英文化学名称为5-（lhydroxy-2，6，6-trlmethyl-4-oxo-2-cyclohexen-l-yl）-3-methyl-2-cis-4-transpentadienoic acid，分子式：C15H20O4，分子量：264.3。脱落酸含有一个不对称碳原子（1位），可形成两种旋光异构体。植物体内的天然ABA具有右旋性，熔点 160161，标志为（S）-ABA或
2、（+）-ABA，CAS：21293-29-8。化学合成的ABA是一种外消旋混合物，含相等数量的（+）-ABA与（-）-ABA或以（R）-ABA表示，熔点为190，CAS：14375-45-2。（+）-ABA和（-）-ABA的分子结构分别如图1和图2所示：图1 （+）-ABA的分子结构示意图图2 （-）-ABA的分子结构示意图（+）-ABA和（-）-ABA两种异构体对涉及蛋白质合成的慢反应（30min）如抑制生长等具有类似活性，但对如气孔关闭等快反应（5min），仅（+）-ABA具生理活性，（-）-ABA则无活性。最近研究表明天然ABA与化学合成ABA（外消旋ABA）在生理作用上亦存在一定差别。
3、（+）-ABA可完全抑制Pharbitis nil形成花芽，但（）-ABA即使在高浓度下也不出现花芽完全抑制现象。换句话说，（+）-ABA兼有快速效应与缓慢效应，而（-）-ABA只有缓慢效应。目前，尚未发现在植物体内这两种异构体能互相转化。 天然脱落酸为白色结晶粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯与三氯甲烷等，难溶于醚、苯等，水溶解度3-5 g/L(20)。脱落酸的稳定性较好，常温下放置两年，有效成分含量基本不变，但应在干燥、阴凉、避光处密封保存。脱落酸水溶液对光敏感，属强光分解化合物。 天然脱落酸与生长素、乙烯、赤霉素、细胞分裂素并列为植物五大激素，它可以提高植物的抗旱和耐盐力，对开
4、发利用中低产田以及植树造林、绿化沙漠等有极高的价值。ABA还是抑制种子萌发的有效抑制剂，因此可以用于种子贮藏，保证种子、果实的贮藏质量。此外，ABA还能引起叶片主孔的迅速关闭，可用于花的保鲜、调节花期、促进生根等，在花卉园艺上有较大的应用价值。对ABA及其应答基因的研究可揭示植物抗逆生理反应的分子过程，从而为定向增强作物对环境的适应力奠定基础。脱落酸在农业生产上有广阔的应用前景，能产生巨大的经济效益和社会效益。因为存在于植物体内的天然脱落酸光学构型仅为(+)-cis, trans-ABA，传统的化学合成法生产成本极高，所以目前只有日本、美国等发达国家应用于大规模农业生产。二、脱落酸的生产工艺与
5、相关专利文献2.1脱落酸的发现过程自从发现生长素以后，人们用它解释植物的生长、顶端优势与向性运动，都可得到较满意的结果，但却难以解释休眠、器官衰老与脱落等生长受抑现象。Hemberg 1949年发现橘树与马铃薯休眠芽提取液含有抑制生长素效应的因素。Bennet Clark和Kefford 1953年将多种植物的酒精提取液的酸性组分进行纸层析，再将各段层析物用燕麦芽鞘法进行鉴定，发现靠近原点的区域，存在着生长促进物质（a-促进剂），而于 Rf值 0.60.7区域内存在生长抑制物质，特称R-抑制剂。此外，Osborne 1955年从黄化的菜豆叶柄提取液中发现一种能促进菜豆外植体第一叶的叶枕形成离层
6、的物质，称为“衰老因子”（SF）。1961年Liu和Carn从吐絮的棉铃得到一种促进落叶的物质，称为脱落素I。遗憾的是，这种物质不仅活性弱，而且后来一直未能再次获得。1963年Ohkuma和Addicott等从棉花幼铃中分离出另一种促进落叶的物质，叫脱落素（abscisin ），同年Eagles和 Wareing从槭叶片分离出一种抑制物质，能导致芽休眠，称为休眠素（dormin）。1965年，Wareing和Addicott等比较休眠素与脱落素的化学结构与性质，证明两者实质上是同一种物质，因此于1967年统一命名为脱落酸（abscisicacid，ABA）。后来逐渐认识到，ABA就是R-抑制剂
7、和SF的最具活性的成分。Ohkuma等1965年用紫外、红外、核磁共振与质谱对棉铃中的ABA进行了光谱分析，提出了 ABA平面结构（如图1所示）。2.2脱落酸的生物合成2.2.1 真菌的ABA合成途径 蔷斑色尾泡霉与豆类煤污尾抱霉（Crosicola与 Ccruenta）是研究真菌ABA合成途径的主要材料，1982年英国的Neill首次从 Croscola分离到l-脱氧ABA，当把（3H）-l-脱ABA供给该菌时，有11转化成 ABA。1983年，Neill和Horgan还查明，（2 H）-芷香叉乙酸（aINAA）（图3II）可经4-羟基-INAA（图3，III）转化成 1-脱氧 ABA（图3
8、， IV）和 ABA。豆类煤污尾泡霉合成ABA的途径与此略有不同，主要表现于法尼醇焦磷酸（FPP）环化后的环上双键的位置，其中间产物之一，4-羟-INAA（图3，VIII），既可经氧化与羟化直接转变成ABA，也可先转化为4-羟-INAA，再形成ABA（Oritani等，1985）。目前认为真菌Crosicola(-芷香途径)、Ccruenta(-芷香途径)、Cpini-clensiflorae和Bcinerea中ABA的合成途径如图3（见下页）所示，单箭头并不表明仅一步反应，点线表明该路径尚需进一步证实。2.2.2 高等植物的ABA合成途径虽然早在1983年，Milborrow等已认为高等植物
9、体内可能存在两条合成ABA的途径：（1）直接途径，由C15前体直接转化为ABA；（2）间接途径，由C40前体裂解成C15化合物，最后转化为ABA。可是直到 1990年，Zeevaart在Plan Growth Substances一书中仍认为，尽管许多证据都支持着C40的间接途径，但还不能最终肯定。近年来，随着若干确凿的实验证据的出现，C40途径才被公认为高等植物的ABA合成途径，而对C15途径的取舍尚有待于进一步研究。图3 真菌Crosicola、Ccruenta、Cpini-clensiflorae和Bcinerea中ABA的合成途径示意图2.2.2.1 C15的直接途径随着真菌Cerco
10、pora与Ccruenta的ABA合成途径的初见端倪，Horgan等就开始探索C15途径是否也存在于高等植物。研究人员用（2H）或（3H）标记的INAA或1-脱氧ABA饲喂几种植物，发现 INAA都能转化成l-脱氧 ABA。但是除了蚕豆叶片能以5的效率将l-脱氧ABA进一步转比成ABA外，菜豆的叶片或未成熟种子、鳄梨果实、番茄、大豆、燕麦、水稻与大麦均缺乏这种能力。对此曾有两种解释；一是大多数供试材料中1-脱氧 ABA尚未进人特定的合成部位，就已经被有关的酶类降解；另一是只有蚕豆才具有将1-脱氧ABA转化成 ABA的酶。但迄今尚未在高等植物体内找到天然的1-脱氧ABA。此外，Crealman等
11、1984年将18O2供给干旱胁迫中的莱豆与苍耳叶片，发现此时大量形成的ABA仅在其侧链上的羟基结合一个 F（18O）。这个事实表明， 1-脱氧 ABA并不是高等植物，或至少不是干旱胁迫时叶片合成ABA的直接前体。 通过饲喂标记的顺-1，4-二羟ABA和反-正，4-二羟ABA的实验发现，这两种化合物都能在蚕豆茎、小麦叶片与鳄梨果实中迅速转化成ABA。早期认为，二羟ABA 4-位的脱氢作用可能会自动进行，但是Hirai等1986年证明，在pH2.57.5的水溶液中，这两种化合物可稳定地保存10天，说明脱氢反应需要酶参加。近来已经在蚕豆种子、鳄梨、豌豆中分别得到这两种化合物。Okamoto等（198
12、7）与Parry等（1988）认为它们很可能是高等植物合成ABA的前体。然而，Vaughan与Milborrow 在1988年提出异议，认为它们最多只是一种ABA的代谢物而不是前体，特别是在酸性条件下它们很不稳定，因此由它们转化为ABA很可能是一种假象。此外，l，2-环氧-芷香叉乙酸能在番茄中转化成ABA，但还不能肯定它是高等植物体内合成ABA的前体。总之，迄今尚不能确认C15的直接途径存在于高等植物。2.2.2.2 C40的间接途径 鉴于ABA的碳架甚至包括氧原子的位置都很像某些类胡萝卜素分子的末端，Taylor和Smith 1967年推测，ABA可能来自紫黄质（Violaxanthin）的
13、裂解产物。他们将荨麻叶片提取液（含紫黄质）曝光，发现形成一种能抑制种子萌发与胚芽鞘伸长的物质，经鉴定为黄质醛（Xanthoxin，XAN）。1971年Burden发现，外供（14C）-（+）-XAN给番茄与矮豌豆，其分别以 10.8与7.0的周转率变成ABA，而且获得外源XAN的番茄地上部的ABA水平可上升约70倍。红光下豌豆生长较慢，植株体内 XAN和 ABA都增加。另外，研究人员还发现：即使没有光照，大豆脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）也可将紫黄质裂解而形成XAN。可是由于绿色叶片中的紫黄质等类胡萝卜素含量远远高于ABA，相当长的时期中一直未能证实ABA合成量与任何一种类胡萝卜
14、素的减少量之间存在着密切的相关。目前已可肯定9-SIS-新黄质是ABA最直接的未裂解前体，而9-CIS-新黄质来自全反式紫黄质。9-Cis-新黄质的裂解产物除XAN外，还有一些副产物：C10化合物ODA或C25化合物丙二烯阿朴醛（allenic apo-aldehyde）。 XAN转变为ABA之前，要先变成ABA-醛。在flC或Sit番茄突变体，因缺乏氧化ABA-醛为ABA的酶，出现了ABA-醇的积累现象。9-CiS-新黄质的裂解反应由一种高周转率的诱导酶所催化，此酶可能是一种二氧合酶（Dioxygenase），分布于质体，特别是叶绿体之中。它的专一性很强，能跨越9-SIS-新黄质的 11-
15、12双键，使之裂解。干旱等胁迫条件下，此酶的合成量或活性增加，从而使XAN加快形成。XAN转比为ABA的反应速度很快。番茄与菜豆叶片的XAN含量仅约110 nggFW，即使在干旱胁迫时，其含量也不增加，而此时的ABA增加速度可达300600 nghgFW。 ABA-醛转变为 ABA的反应由一种酶所催化，此酶存在于液泡之中，需要含铅的辅因子。Scholten等（1985）与Walker Simmons等（1989）先后在大麦nar2a与拟南芥硝酸还原酶突变体获得了这方面的实验证据。从图4可见9-CIS-新黄质经一系列反应转化为ABA的过程。其中，9-Cis-新黄质的裂解反应是整个过程中的限速枢纽。图4 高等植物中ABA合成的推想途径2.2.3 有关脱落酸生产的专利文献有关脱落酸生产的中国专利有两项，下面分别予以简要介绍：2.2.3.1 真菌发酵生产天然脱落酸的新方法（已授权） 公告号： 公告日：2001.6.27 申请日：1996.11.18 颁证日：2001.5.2 申请号：.5 申请人：中国科学院成都生物研究所地址：四川省成都市人民南路四段九号， 发明人：谭红 李志东 丁立生 彭树林 摘要：本发明属于用真菌发酵生产天然活性脱落酸的新方法。本法通过改造现有脱落酸菌，改变培养
