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1、 胰岛素的结构和性质 (北京大学化学与分子工程学院北京)摘要胰岛素是与人类健康有密切关系的蛋白质激素。在蛋白质的结构与功能研究中占有特殊的地位。本文对胰岛素的基本知识如胰岛素的发现,胰岛素的一级结构和高级结构,胰岛素的生物合成,胰岛素的生物活性及在临床上的应用进行简要的介绍。胰岛素(insulin)是一种蛋白质类激素。体内胰岛素是由胰岛细胞分泌的。在人体胃的后下部,十二指肠旁,有一条长形的器官,叫做胰腺(图1)。在胰腺中散布着许许多多的细胞群,叫做胰岛(图2)。人胰腺中胰岛总数约有100万个1。胰岛素是由胰岛细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋
2、白质激素,是最早从胰腺中得到的激素,在蛋白质的结构与功能的研究中取得了多个第一。它是第一个被证明有激素作用的蛋白质,第一个被结晶的蛋白质,第一个被测定氨基酸序列的蛋白质,图1人体胰腺(在胃的后下部)图2胰腺中的胰岛第一个被人工合成的蛋白质,第一个被证明是以大分子前体形式合成的蛋白质和第一个用基因工程生产的蛋白质2 。1胰岛素的发现由于胰岛散布在胰外分泌腺的汪洋大海中,因此在提取胰岛素时极易被蛋白水解酶降解而失活。加拿大外科医生FrederrickGrantBanting看到一篇报道,提到在胰脏外分泌细胞坏死时,胰岛细胞仍然存活。于是他对胰岛中的活性物质产生了浓厚的兴趣,希望能提取、分离胰岛中的
3、活性物质。但当时他在英国工作的实验室条件较差,于是求助于多伦多大学生理系专门研究糖代谢的J.J.R.Macleod教授,希望他给予支持。Banting要求提供一间实验室及有关设备、一名协助他测定血糖和尿糖的助手以及实验用的狗等。当时Macleod教授勉强同意了Banting的要求并找了一名当时在多伦多大学医学院学习的四年级学生CharlesH.Best作为Banting的助手34 。研究工作在1921年暑假中进行,他们克服了许多困难和经历了多次失败后,结扎了几只狗的胰导管,7周后,这些狗的胰腺都萎缩了,并失去了消化器官的功能,而 胰岛从外观上看仍然是完好的。他们从狗的萎缩胰脏中抽提出具有活性的
4、提取液,然后给切除胰脏并患有糖尿病的狗注射有活性的提取液,经过反复调节注射液的剂量,使几只切除胰脏并患有糖尿病的狗得以生存数周,其中一只患有严重糖尿病的狗居然存活了70天3;而作为对照实验,没有被注射有活性提取液而切除胰脏的狗,则因糖尿病几天后就死去了。Banting开始把提取的活性物质命名为isletin。Macleod度假回来得知Banting的研究取得了令人兴奋的结果后,立即将他实验室的主要研究方向转向Banting开创的课题,并将胰岛素isletin更名为insulin。Banting与Best于1922年发表了他们的研究结果,并将初步纯化的动物胰岛素成功地应用于糖尿病人。1923年,
5、由于该项研究成果,Banting与Macleod获医学和生理学诺贝尔奖。胰岛素的发现被认为是糖尿病史上的里程碑事件。为了纪念Banting的贡献,美国糖尿病协会把每年全美糖尿病研究的最高奖项命名为Banting奖。胰岛素的发现激发了各个领域科学家的兴趣,促进了关于胰岛素的生物合成、一级结构与高级结构的研究、化学合成、生物功能与作用机制的研究,在蛋白质的结构与功能的研究中取得前面提到的多个第一的重大成就。2胰岛素的一级结构与高级结构自从胰腺中提取的胰岛素得到结晶后,英国科学家Sanger从1945年起,历经10年的研究,先将牛胰岛素拆分成两条链,然后用酸和蛋白水解酶分别进行部分水解得到一些小的肽
6、片段,再用2,4二硝基苯(Sanger!s试剂,DNP法)分别测定了两条链的氨基酸顺序56,于1955年报道了胰岛素的一级结构7。1958年,Sanger因为该项成果获诺贝尔化学奖8。继牛胰岛素的结构测定后,Sanger等人又测定了猪、羊胰岛素的一级结构。现在,各种常见动物的胰岛素的一级结构均已阐明。图3是猪胰岛素分子的一级结构示意图。圆圈中的字母代表不同氨基酸残基的缩写符号。由其一级结构可知,猪胰岛素相对分子质量为5734,等电点为5.35。A、B两条肽链共由51个氨基酸残基组成。A链含有11种21个氨基酸残基,N端为Gly,C端为Asn,A链本身的6位和11位上的两个Cys通过二硫键相连成
7、环;B链含16种共30个氨基酸残基,其N端为Phe,C端为Ala。A链和B链又通过2个二硫键互相连接成胰岛素分子。不同动物胰岛素的一级结构中部分氨基酸残基是不同的。例如猪胰岛素A链的第8、9、10位氨基酸残基是Thr、Ser和Ile;牛胰岛素为Ala、Ser、Va;l而马胰岛素则为Thr、Gly和Ile。人胰岛素和猪胰岛素仅在B链第30位氨基酸残基有区别(人胰岛素为Thr,猪胰岛素为Ala)。由于不同来源的胰岛素结构差异,它们的抗原性不同,临床上应用与人胰岛素结构差异最小的猪胰岛素作为治疗药剂,也正是基于上述考虑。我国科学家历经6年多时间,于1965年完成了结晶牛胰岛素的全合成。经过严格鉴定,
8、它的结构、生物活力、物理化学性质、结晶形状都与天然的牛胰岛素完全一样。这是世界上第一个人工合成的蛋白质9。1969年,英国科学家Hodgkin用X射线晶体学分析揭示了分辨率为1.9的猪胰岛素的三维结构10。胰岛素分子晶体由6个胰岛素分子和2个Zn2+形成含锌胰岛素的六聚体。首先,2个胰岛素分子形成二聚体,然后3个二聚体围绕三重轴形成对称的排列,B链第10位上组氨酸的咪唑基与轴上的Zn2+组成配位键。胰岛素晶体中锌的含量为0.4%0.5%。六聚体也是胰岛素在细胞中的储存形式。我国科学家在1969年至1974年期间先后以4(1970)、2.5(1971)、1.8(1973)分辨率,测定了猪胰岛素三
9、方二锌晶体结构。这是继人工20合成胰岛素之后我国蛋白质科学研究的又一重要成果11。这些研究成果为深入研究胰岛素分子结构与功能的关系奠定了基础。胰岛素的一级结构与其生物活性有密切关系。如用胰蛋白酶水解胰岛素,去除B链C端的8肽,生物活性只剩1%。B23甘氨酸、B24苯丙氨酸等均为维持胰岛素生物活性所必需。二硫键被还原使胰岛素分解为A链和B链后,胰岛素的生物活性完全丧失。3胰岛素的生物合成在研究胰腺的胰岛细胞腺瘤的过程中,Staeiner发现了一个新的蛋白质,它是胰岛素生物合成的前体,命名为胰岛素原(proinsulin)12。胰岛素原是一条单一的多肽链(86肽),它包含一个由31个氨基酸残基组成
10、的连接肽。这个连接肽(称为C肽)连接B链的C端和A链的N端。当胰岛素原的二硫键被还原然后重新氧化时,可以形成正确的二硫键配对。胰岛素原的基本结构是(B链)ArgArg(C肽)LysArg(A链),在C肽的N端和C端通过碱性氨基酸二肽把A链和B链连接起来。图4前胰岛素原加工成胰岛素的示意图13 继发现胰岛素原之后,Staeiner又发现了一个能被胰岛素抗体沉淀的蛋白质,相对分子质量为11500,命名为前胰岛素原(preproinsulin)13。胰岛素原的N端进一步延长20个左右的氨基酸残基(信号序列)就是前胰岛素原。不同生物体的信号序列长短有所不同。目前我们所了解的胰岛素的生物合成过程示意图见
11、图4。21人前胰岛素原也可用以下简式表示:前胰岛素原酶胰岛素原酶胰岛素110氨基酸残基86氨基酸残基51氨基酸残基(2个二硫键连接A链和B链)胰岛素是在胰岛细胞内质网的核糖体中合成的。首先,胰岛素结构基因在RNA聚合酶的作用下,转录生成前胰岛素原的信使核糖核酸(mRNA),后者从细胞核转入胞浆,在多核糖体内翻译为前胰岛素原。前胰岛素原的信号序列被信号肽酶切断生成胰岛素原。胰岛素原进入内质网腔后,内质网逐渐鼓起胞芽,并脱落生成小泡,这些小泡向高尔基体移动,并与之结合成为高尔基体的一部分。胰岛素原随着小泡进入高尔基体。在高尔基体内,胰岛素原被包裹成为未成熟颗粒。然后,在激素原转换酶2(PC2)和激
12、素原转换酶3(PC3)及羧肽酶H的作用下,脱去连接胰岛素和C肽分子两侧的两个碱基氨基酸(3132位ArgArg,6465位LysArg),产生等量的胰岛素和C肽,整个过程约需几小时。随着胰岛素原的分解,未成熟颗粒逐渐成为成熟颗粒。颗粒内的胰岛素与Zn2+结合形成含锌胰岛素晶体。合成的胰岛素储存在胰岛细胞的颗粒中。成人胰岛内贮存的胰岛素约200国际单位(IU)1415。4胰岛素的生物活性及临床应用胰岛素的生物效应包括许多方面,它是体内唯一能降低血糖的激素。也是唯一同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素。胰岛素的主要靶器官为肝脏、肌肉及脂肪组织,它控制着三大营养物质糖、蛋白质、脂肪的代谢和贮存。最明
13、显的作用是影响糖的代谢,降低血糖16,即促进肝脏及肌肉组织中葡萄糖的利用,激活糖原合成酶和丙酮酸脱氢酶等的活性,促进糖原的合成并抑制糖原的分解。此外,对肝脏来说还有抑制蛋白质分解的作用;在肌肉组织中促进K+从细胞外向细胞内的转运;在脂肪组织中促进氨基酸由细胞外向细胞内转运,促进脂肪的合成,抑制脂肪的分解等作用。这些在细胞水平上对代谢系统的作用是基于胰岛素与其受体的结合得以实现的15。总之,胰岛素之所以能降低血糖,是因为它促进了靶细胞对葡萄糖的摄取(增加膜对葡萄糖的通透性)、贮存(合成肝糖原和肌糖原)和利用(用于合成脂肪和蛋白等)。当胰岛受到破坏、胰岛素分泌减少或机体组织对胰岛素的敏感性降低(胰
14、岛素的受体失效)时,则血糖升高,尿中出现葡萄糖,发生糖尿病(diabetesmellitus)。糖尿病是一种慢性代谢性疾病。也是一个影响着数亿人的复杂疾病。由于体内胰岛素相对或绝对不足,形成持续性高血糖,导致许多组织器官代谢异常,继而产生功能障碍及形态学异常。它是一种终生疾病。如果胰岛机能亢进,则出现血糖过低,能量供给不足,甚至影响大脑机能。胰岛细胞分泌的另一种多肽激素叫胰高血糖素(glucagon),是由29个氨基酸残基组成的单链多肽,其生物活性与胰岛素相反,通过刺激糖原分解提高血糖水平。所以它是升高血糖的激素。胰高血糖素主要作用于肝脏,刺激糖原分解,使血糖水平提高17。这对大脑的功能特别重
15、要,因为神经元绝对依赖葡萄糖作为能源。当血糖浓度降到正常值以下时,肌体迫切需要注入葡萄糖到血液。这时胰高血糖素作用于肝细胞,促进糖原分解和异生,以提高血糖的浓度2。有机体是一个精密调控的复杂体系,由不同生物活性的激素和其他活性物质的作用和相互制约,才能维持肌体的正常运转。胰岛素依赖型糖尿病称#型糖尿病,胰岛素绝对不足占主导地位,所以在治疗中必须补充胰岛素。非胰岛素依赖型糖尿病称型糖尿病,多数因胰岛素相对不足,治疗中是否补充胰岛素可根据病情而定16。糖尿病人中5%10%属于#型糖尿病,约4%的孕妇患有妊娠期糖尿病1。目前在临床上应用的胰岛素大部分已用人胰岛素代替了过去常用的动物胰岛素如猪胰岛素、牛胰岛素等,因为重组人胰岛素的问世才可能为糖尿病人提供人胰岛素。据报道,我国现在已成功研制、开发出具有自主知识产权的基因重组人胰岛素,改变了长期以来依赖进口的局面。虽然注射人胰岛
