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1、实验（七） 脱氢酶活性测定脱氢酶的正式命名应是AH：B氧化还原酶，它能酶促自一定的基质中脱出氢而进行氧化作用。脱氢酶广泛存在动植物组织和微生物细胞内。脱氢酶的种类因电子供给体和接受体的特异性而有不同。单位时间内脱氢酶活化氢的能力表现为它的酶活性。通过测定活性污泥或土壤中微生物的脱氢酶活性，可以了解微生物对污泥或土壤中有机物氧化分解能力，即污泥酶或土壤酶的活性。利用已知受氢体能接受脱氢酶脱出的氢原子，如无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride）,俗称红四唑，接受氢后变成红色的三苯基甲臜（TF，triphenyl formazan）,
2、根据产生红色的色度进行比色定量分析，以判断脱氢酶活性。TTC作为受氢体，其还原过程可用下式表示。 H HN-N-C6H5 N-N-C6H5 C6H5- +2e- C6H5 - +HCL + +2H+N=N-C6H5 N=N-C6H5 CI (无色TTC) (红色TF)根据红色的深浅，测出相应的吸光值（A值），求出脱氢酶的活性。通常A值越大（红色深），脱氢酶活性越高。11 材料与方法(1)材料 活性污泥悬浮液或土壤悬浮液。(2)方法 分光度法。要点所有操作应当尽量在避光条件下进行。脱氢酶最适反应条件，温度3037,PH 值7.48.5。取用甲醛时要小心，不要碰到皮肤上，如若沾到皮肤上要迅速用自来
3、水冲洗。22 实验步骤（1）绘制TTC标准曲线配制系列浓度的TTC标准溶液。先取5支50mL带塞比色管，按顺序尽快分别加入0.36Na2So3溶液2.5ml，Tris-HCl缓冲液（pH值7.6）7.5mL在分别吸取0.4TTC 溶液0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL,放入5支比色管中，用蒸馏水定容至50mL,使成8gmL-1、32gmL-1、40gmL-1系列浓度。同时另取一支50mL比色管，加入0.36Na2SO3溶液2.5mL,Tris-HCl缓冲溶液（pH值7.6）7.5mL,加入蒸馏水至50mL,作为空白对照。向每支比色管中各加入少许（十几粒）连二亚硫酸钠（N
4、a2SO4）混匀，使TTC全部还原成红色的TF(三苯基甲臜)。向各管滴加5mL甲醛终止反应，摇匀后加入5mL丙酮振荡摇匀，37水浴10分钟。在485波长下测定吸光值A。以A值为纵坐标，TTC浓度为横坐标，绘制出TTC标准曲线。（2）活性污泥脱氢酶活性的测定(略)活性污泥悬浮液的制备 取50mL活性污泥液（约1.53gL-1）放入三角瓶中，加入数粒玻璃珠剧烈摇动将污泥打碎。40000r.min-1离心5min,弃去上清液，再用生理盐水补充水分，悬浮，洗涤，离心，反复三次。最后用生理盐水补至原体积。取4个40mL据塞离心管(1个对照，3个平行)，分别加入Na2SO3 溶液0.5ml，Tris-HC
5、L缓冲液（PH值7.6）2.0ML，污泥悬浮液2mL，0.4TTC液0.5mL(对照管不加TTC液，以0.5mL蒸馏水取代），使最终体积都为5mL,盖紧塞子。将离心管摇匀，立即放入37水浴中培养10分钟（以显色为准）。各管分别加入0.5mL甲醛终止反应。再向各管分别加入5mL丙酮振摇数十次，37水浴保温10分钟。4000r.Min-1离心5分钟，取上清液在485nm波长下测定A值并在标准曲线上查出相应得TTC浓度。（3）土壤脱氢酶活性的测定取3个50mL具塞比色管，分别称取通过2mm筛的土样5g，加入比色管中，再加入5mL0.4TTC液，另取一个50mL具塞比色管加入同种土样的灭菌土5g，也加
6、入5mL0.4TTC液，作为对照。将以上4个具塞比色管避光，37水域锅中保温培养1224h。培养结束后，加入5mL甲醛终止反应，再分别加入5mL丙酮振荡并在37保温10分钟，转入离心管。4000r.min-1离心5分钟，取上清液在485nm波长下测定A值，在标准曲线上查出相应的TTC浓度。33结果与讨论（1）脱氢酶活性的计算脱氢酶活性=ABC （6-5）式中，A为由标准曲线上查出的TTC浓度，(g.mL-1);B为培养时间校正值（h）;C为比色时稀释倍数，当A值大于0.8时，要适当稀释，使A值在0.8以下。（2）影响脱氢酶活性的因素有哪些？（3）已知乳酸脱氢酶（LDH）在DAD+的递氢作用下，
7、是乳酸脱氢生成别丙酮酸。丙酮酸在碱性溶液中与2，4-二硝基苯肼生成2，4-二硝基苯腙使溶液呈棕色。颜色的深浅与丙酮酸浓度成正比。请设计一个测定动物肝脏乳酸脱氢酶活性的实验。要点 丙酮酸标准溶液配制称取丙酮酸钠11mg，用0.05mol.L-1硫酸溶解后，定容至100mL，置冰箱中保存。总黄酮生物总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分。在自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄（醇）、异黄酮、双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类等。简介近年来，由于自由基生命科学的进展，使具有很强的抗氧化和消除自由基作用的类黄酮受到空前的重视。类黄酮参与
8、了磷酸与花生四烯酸的代谢、蛋白质的磷酸化、钙离子的转移、自由基的清除、抗氧化活力的增强、氧化还原作用、螯合作用和基因的表达。它们对健康的好处有：（ 1 ） 抗炎症 （ 2 ） 抗过敏 （ 3 ） 抑制细菌 （ 4 ） 抑制寄生虫 （ 5 ） 抑制病毒 （ 6 ） 防治肝病 （ 7 ） 防治血管疾病 （ 8 ） 防治血管栓塞 （ 9 ） 防治心与脑血管疾病 （ 10 ） 抗肿瘤 （ 11 ） 抗化学毒物 等。天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能时入脂肪组织，进而体现出如下功能：消除疲劳、保护血管、防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器细胞的功能、抗脂
9、肪氧化、抗衰老。 近年来国内外对茶多酚、银杏类黄酮等的药理和营养性的广泛深入的研究和临床试验，证实类黄酮既是药理因子，又是重要的营养因子为一种新发现的营养素，对人体具有重要的生理保健功效。目前，很多著名的抗氧化剂和自由基清除剂都是类黄酮。例如，茶叶提取物和银杏提取物。葛根总黄酮在国内外研究和应用也已有多年，其防治动脉硬化、治偏瘫、防止大脑萎缩、降血脂、降血压、防治糖尿病、突发性耳聋乃至醒酒等不乏数例较多的临床报告。从法国松树皮和葡萄籽中提取的总黄酮 碧萝藏 - （英文称 PYCNOGENOL ）在欧洲以不同的商品名实际行销应用 25 年之久，并被美国 FDA 认可为食用黄酮类营养保健品，所报告
10、的保健作用相当广泛，内用称之为 类维生素 或抗自由基营养素，外用称之为 皮肤维生素 。进一步的研究发现碧萝藏的抗氧化作用比 VE 强 50 倍，比 VC 强 20 倍，而且能通过血脑屏障到达脑部，防治中枢神经系统的疾病，尤其对皮肤的保健、年轻化及血管的健康抗炎作用特别显著。在欧洲碧萝藏已作为保健药物，在美国作为膳食补充品（相当于我国的保健食品），风行一时。随着对生物总黄酮与人类营养关系研究的深入，不远的将来可能证明黄酮类化合物是人类必需的微营养素或者是必需的食物因子。性状：片剂。 功能主治与用法用量功能主治：本品具有增加脑血流量及冠脉血流量的作用，可用于缓解高血压症状（颈项强痛）、治疗心绞痛及
11、突发性耳聋，有一定疗效。 用法及用量：口服：每片含总黄酮，每次片，日次。 不良反应与注意不良反应和注意：目前,暂没有发现任何不良反应. 洛伐他丁【中文名称】： 洛伐他丁 【英文名称】： Lovastatin 【化学名称】：(S)-2-甲基丁酸-(1S,3S,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-六氢-3,7-二甲基 -8-2-(2R,4R)-4-羟基-6氧代-2-四氢吡喃基-乙基-1-萘酯 【化学结构式】： 洛伐他丁结构式【作用与用途】洛伐他丁胃肠吸收后，很快水解成开环羟酸，为催化胆固醇合成的早期限速酶（HMGcoA还原酶）的竞争性抑制剂。可降低血浆总胆固醇、低密度脂蛋白和极低密度脂
12、蛋白的胆固醇含量。亦可中度增加高密度脂蛋白胆固醇和降低血浆甘油三酯。可有效降低无并发症及良好控制的糖尿病人的高胆固醇血症，包括了胰岛素依赖性及非胰岛素依赖性糖尿病。 【 用法用量】口服：一般始服剂量为每日 20mg，晚餐时1次顿服，轻度至中度高胆固醇血症的病人，可以从10mg开始服用。最大量可至每日80mg。 【注意事项】病人既往有肝脏病史者应慎用本药，活动性肝脏病者禁用。副反应多为短暂性的：胃肠胀气、腹泻、便秘、恶心、消化不良、头痛、肌肉疼痛、皮疹、失眠等。洛伐他丁与香豆素抗凝剂同时使用时，部分病人凝血酶原时间延长。使用抗凝剂的病人，洛伐他丁治疗前后均应检查凝血酶原时间，并按使用香豆素抗凝剂
13、时推荐的间期监测。他汀类药物他汀类药物(statins)是羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌。 他汀类药物分为天然化合物(如洛伐他丁、辛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀)和完全人工合成化合物(如氟伐他汀、阿托伐他汀、
14、西立伐他汀、罗伐他汀、pitavastatin)是最为经典和有效的降脂药物，广泛应用于高脂血症的治疗。 他汀类药物除具有调节血脂作用外，在急性冠状动脉综合征患者中早期应用能够抑制血管内皮的炎症反应，稳定粥样斑块，改善血管内皮功能。延缓动脉粥样硬化（AS）程度、抗炎、保护神经和抗血栓等作用。 结构比较辛伐他汀（Simvastatin）是洛伐他汀（Lovastatin）的甲基化衍化物。 美伐他汀（Mevastatin，又称康百汀，Compactin）药效弱而不良反应多，未用于临床。目前主要用于制备它的羟基化衍化物普伐他汀（Pravastatin）。 体内过程洛伐他汀和辛伐他汀口服后要在肝脏内将结构中的其内酯环打开才能转化成活性物质。 相对于洛伐他汀和辛伐他汀，普伐他汀本身为开环羟酸结构，在人体内无需转化即可直接发挥药理作用，且该结构具有亲水性，不易弥散至其他组织细胞，极少影响其他外周细胞内的胆固醇合成。 除氟伐他汀外，本类药物吸收不完全。 除普伐他汀外，大多与血浆蛋白结合率较高。 用药注意大多数患者可能需要终身服用他汀类药物，关于长期使用该类药物的安全性及有效性的临床研究已经超过10年。他汀类药物的副作用并不多，主要是肝酶增高，其中部分
