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1、 Small RNA Research based on NGS姓名：刘灿学号：201311689第 1 章 前言1.1 ncRNA 定义和分类ncRNA（none coding RNA）即不编码蛋白质的 RNA。主要包括rRNA，tRNA，snRNA ，snoRNA 和 microRNA 等多种已知功能的 RNA，当然还包括未知功能的 RNA。根据其长度分布，我们可以将其大致分为三类：小于 50nt，包括 miRNA、siRNA、piRNA。在 50-5oont 之间，包括有 rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、SLRNA、SRPRNA 。大于 500nt，包括 LncRNA、mR
2、NA-like 的非编码 RNA、长的不带 polyA 尾巴的非编码 RNA 等等。1.2 miRNA 的介绍1.2.1 miRNA 的定义小 RNA 是指一类具有调控基因表达作用的非编码的小分子 RNA，其长度一般控制在1830nt 之间。miRNA（micro RNA）是我们常见的小 RNA 之一。其长度控制在 18-25nt 之间，经过较长的初级转录物在一系列的核酸酶的剪切加工后形成，随后可以组装进入 RNA 诱导的沉默复合体，通过间几乎不配对的方式来识别 mRNA，后根据互补程度的大小来知道沉默复合体降解靶 mRNA 或者阻遏相关 mRNA 的翻译，从而起到抑制某目的基因表达的作用，在
3、近 10 年里获得了广泛的关注与应用。1.2.2 miRNA 的作用特点miRNA 作为内源性的单链小分子 RNA，对 mRNA 进行转录后的表达调控。miRNA 与靶 mRNA 只需要部分的互补就可以起到作用。预测有 30%的基因会受到 miRNA 的调节，其中一个 miRNA 可以调控多个 mRNA，而一个 mRNA 又可以收到多个 miRNA 的调控。1.2.3 miRNA 的表达特点miRNA 具有较强的偏好性， 5端偏好碱基 U，第 10 位碱基偏好 A。前体长度存在种间差异，动物约为 7090nt，而植物的较长，约为 130nt 左右。miRNA 的表达具有时空特异性，特别是组织表
4、达的差异。miRNA 中 60%为独立表达，15%具有成簇表达（即表达具有相关性）的特点。虽然 miRNA 广泛存在与各个物种，但具有高保守性，涉及到成熟序列，种子序列以及部分物种的前体序列也是保守的，这样就为我们在新的物种中发现 miRNA提供的参考价值。以 let-7 家族为例，其中我们在线虫中发现了 4 个，人的基因组中发现了15 个，以及在果蝇中发现了 1 个。1.3 miRNA 的研究方向miRNA 功能的发掘中 miRNA 的网络化研究，涉及 miRNA 与靶基因的交互作用和通路内 miRNA 的协同与竞争作用的研究， miRNA 的活性研究，例如 miRNA 降解 mRNA 的效
5、能等。近几年又新发现了一种可以调节 miRNA 沉默效应的 RNAcircular RNA。环状 RNA可以与 miRNA 结合，降低 miRNA 与 mRNA 的结合从而降低对 mRNA 的干扰作用，这主要得益于环状 RNA 的特异的剪接方式，在其末端有较多的重复序列。整个链上有非常丰富的 miRNA 结合位点，结合方式与靶基因类似但有独特的结合方式，与 miRNA 两端有高的匹配程度，中间匹配松散，这种结构有利于吸收 miRNA 并可保护本身不被 miRNA 降解。但不容忽视的是环状 RNA 作用具有海绵效应。一个 cir RNA 可以捕获多个 miRNA，但是 cir RNA 的解体会在
6、短时间内释放出很多的 miRNA，miRNA 的相对表达增多。释放出的 miRNA 依然可以作用于有相同的 MRE 的 mRNA.第二章 小 RNA 测序信息分析流程简介2.1 方案制定真核生物目标小 RNA 分离及测序策略选择2.2 样品检测一般浓度要求:total RNA=200ng/ul总量要求：total RNA=10ug2.3 文库制备与测序原核生物 ncRNA 分离与测序应结合实际捕获灵活构建文库2.4 信息分析针对原始数据先要进行质控与过滤，例如针对碱基质量，测序的错误率，并且去掉接头。并且可以根据获得的 miRNA 长度分布鉴定样品质量。2.4.1 鉴定 miRNA针对已知的
7、miRNA，我们可以使用 BLASTN，miRBase，或者 match_hairpin.aln 来实现查找。鉴定条件较多，例如可根据 miRNA 碱基偏好性。但针对在 mirbase 中没有收录的物种的 mi 人、RNA ，我们可以根据成熟体 miRNA 的序列保守型，物种边界大小对序列保守鉴定的影响以及其存在的前体颈环结构来进行鉴定。为了排除预测干扰，通过与其他 ncRNA 数据库、repeat 数据库以及基因组中 exon 数据库比较，去除这些数据（数据库 Genebank、Rfam、repeat、exon、siRNA、piRNA 等） 。获得符合条件的数据，根据序列在基因组上的定位情况
8、，使用 mireap 软件进行预测。2.4.2 预测 novel miRNA前体长度一般控制在 35nt 左右，并且发卡结构有高度保守的模序，miRNA 位于发卡结构的两臂上。Noval miRNA 的酶切位点具有保守性，且发卡前体有较低的折叠自由能。2.4.3 预测靶基因在完成以上工作后，我们就可以进行靶基因的预测。我们以植物中的 miRNA 靶基因预测分析为例，可以设计以下的筛选条件：1）少于 4 个碱基的错配2）不能有任何连续的两个错配3）在 10,11 为不允许有错配（高度保守）4）在 2-12nt 见少于 2.5 个错配5）5端 112nt 不允许有错配样品降解所致植物峰值动物峰值6
9、）最小自由能不能低于成熟体的 75%2.4.4 靶基因功能注释与分类利用 Gene Ontology (GO) enrichment analysis 和 KEGG pathway analysis，对预测得的靶基因进行功能注释与分类，进一步了解 miRNA 的效用原理。第三章 案例分析miRNA 作为内源性的单链小分子 RNA，对 mRNA 进行转录后的表达调控。大量的研究已经表明 miRNA 会控制各种鱼生物和代谢过程相关的基因。在众多模式植物中，例如拟南芥和水稻，现已经完成了更进一步 miRNA 的发现与功能研究，针对多种重要的经济作物，例如大豆等也进行了类似的实验与分析。本文就以花生为
10、例，利用高通量测序技术支持，进行一系列的过滤与分析，找到了 75 个保守的 miRNA 和 14 个物种特有的miRNA，并通过 RT-PCR 进行验证，表明其中存在至少 22 个保守的 miRNA 和 14 个物种特有 miRNA 在花生生长，发育以及环境胁迫情况下起到重要的调节作用。也为未来miRNA 研究提供大量可参考资源。3.1 试验流程3.2 实验中遇到的瓶颈测序结果在 Mirbase 中并没有找到对应的 miRNA。3.3 应对策略文章中选择数据库中收录的近源（生物进化）物种 35 个，在这个范围内收录的miRNA 可以作为该物种的 conserved miRNA。构建本物种潜在的
11、 conserved 数据库后，将不同物种间进行比对，选出比对效果最好的表达强度最高的序列，以此筛选出本物种中的conserved miRNA。将筛选出的 miRNA 对应的成熟体序列进行二级结构预测，完成前提验证。结果文章中发现了 14 个新的 miRNA 家族和 75 个保守的 miRNA。除了 ahy-miRn1 在大豆中有一个同源体以外，其它 13 个 miRNA 是没有在其它植物物种中找到同源体而被认为是物种特有的。最后通过 RT-PCR 分析证实了保守的和花生特有的 miRNA 都在花生中真实表达。值得我们注意的是，预测的 miRNA，由于基因组不完整，可能会无法预测到前体，造成一部分结果的缺失。并且预测出来的信的 miRNA 的表达实在特定环境下和组织中表达的。
