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1、基因检测新进展 郑州大学第一附属医院 河南省卫生厅临床检验中心 明亮 1 目 录 基因检测的技术方法 基因检测的应用进展 2 3 基因与基因检测 1 2 第1部分 基因与基因检测 3 什么是基因？ 基因是编码RNA和蛋白质的核苷酸序列；大部分 生物中构成基因的核酸物质是DNA，少数生物 （如RNA病毒）中是RNA。 地球上人与人之间基因序列的差异仅仅为万分之 一，其中99.99%序列是相同的。 4 DNA的分子结构 磷酸 脱氧核糖 碱基 5 格里菲斯证明遗传物 质是核酸 1928年年1929年年1952年年1953年年1970年年 科赛尔和琼斯以及列文发现核酸由 核苷酸组成，核苷酸由碱基、核糖
2、 和磷酸构成。 赫尔希证明DNA具有遗传功能 沃森和克里克提出DNA的双螺旋 结构和自我复制机制 克里克提出完整的中心法则模式 基因的发现历程 1961年年 马太和尼伦伯格破解出Phe的密 码子（UUU） 6 什么是基因检测？ 基因检测是通过血液、体 液或细胞对DNA分子信 息作检测，预知身体患 疾病的风险，分析基因 情况。基因检测可以诊 断疾病，也可以用于疾 病风险的预测。 7 基因检测的发展历史 1990s 2000s 2010s 1994年，美国率先在一些 人群中开展肠癌基因筛检 1990年，人类基因 组计划正式启动 2002年，欧盟有超过70 万人进行了基因检测实验 2004年，世界卫
3、生组织推 出基因检测国际标准 2015年，奥巴马人类基因组 计划所取得的成果，并宣布 了新的项目精准医疗 8 基因检测风靡全球 9 第2部分 基因检测的技术方法 10 基因检测的技术方法 基因异常的形式有很多种，所适用的检测方法 也有很多种 不同的检测方法相互弥补，难以完全替代 根据检查目的，选择合适的检测方法很重要 11 基因检测的技术方法 杂交杂交扩增扩增测序测序 Southern杂交 Northern杂交 荧光原位杂交 基因芯片 一代测序（Sanger测序法） 二代测序（NGS） 三代测序（NNGS） 逆转录PCR 反向PCR 巢式PCR 原位PCR 多重等位基因PCR 不对称PCR 锚
4、定PCR 长片段PCR 荧光定量PCR 12 2.1 荧光原位杂交（FISH） FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补 的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的 杂交双链核酸。 广泛应用于基因组结构研究、 染色体精细结构变异分析、病 毒感染分析、人类产前诊断、 肿瘤遗传学和基因组进化研究 待许多领域。 BCR ABL BCR/ABL 13 实时荧光定量实时荧光定量PCR检测技术检测技术 (外标法）外标法） 普通普通PCR检测技术检测技术 高敏感度内标荧光定量高敏感度内标荧光定量PCR 检测技术（内标法）检测技术（内标法） 2.2 聚合酶链式反应（PC
5、R） 14 PCR 的基本反应步骤的基本反应步骤 模板模板DNADNA 9494变性变性 5555退火退火 7272引物延伸引物延伸 经历经历2525- -3030个循环个循环 目的目的DNADNA增加增加101067 67 第二个循环第二个循环 以DNA一条链为模板 聚合酶 引物 以半保留复制原则合成新的DNA 聚合酶链式反应（PCR）的原理 15 2.3 基因测序 16 2.3.1 一代测序（Sanger测序，双脱氧链终止法） Sanger法的原理是：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板， 以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系 中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（
6、ddNTP）作为链延伸终止剂。在测 序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短 不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离， 放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按53方向读出新合成链序列， 由此推知待测模板链的序列 。 17 第二代测序技术，主要包括罗氏454公司的GS FLX测序平台、 Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的 SOLiD测序平台。 第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万 条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度 测序变得方便易行。 2.3.2 二代测
7、序nextgeneration sequencing 18 单分子即时DNA测序技术(SMRT) HeliScope单分子测序 基于荧光共振能量转移的即时DNA测序 纳米孔单分子测序技术 2.3.3 三代测序 单分子测序技术 速度更快 片段更长 精度更高 可直接测RNA序列。 可直接测甲基化的DNA序列。 19 一至三代测序技术比较 20 第3部分 基因检测的应用进展 21 3.1 肿瘤靶向治疗 22 靶向治疗的进展 基因检测 方案1 方案2 方案3 23 肿瘤靶向药物（部分） 疾病疾病相关靶标基因相关靶标基因相关基因位点相关基因位点药物名称药物名称指导意义指导意义 非小细胞肺癌 EGFREG
8、FR基因突变基因突变 1818、19、20、21 外显子外显子 吉非替尼 （易瑞沙） 埃罗替尼 （特罗凯） 1 1、野生型疗效差野生型疗效差 2、突变型疗效显著增加突变型疗效显著增加 3、Exon20中中790密码子发生突变密码子发生突变，可可 能出现继发性耐药能出现继发性耐药 KRASKRAS基因突变基因突变1212、13、61密码子密码子 1 1、野生型疗效较好野生型疗效较好 2、突变型疗效显著降低突变型疗效显著降低 结肠直肠癌 KRASKRAS基因突变基因突变1212、13、61密码子密码子 西妥昔单抗 （爱必妥） 帕尼单抗 （维克替尼） 1 1、野生型疗效较好野生型疗效较好 2、突变型
9、疗效显著降低突变型疗效显著降低 BRAFBRAF基因突变基因突变466466、600、616密码子密码子 1 1、野生型疗效较好野生型疗效较好 2、突变型疗效显著降低突变型疗效显著降低 PIK3CAPIK3CA基因突变基因突变1919、20外显子外显子 1 1、野生型疗效较好野生型疗效较好 2、突变型疗效显著降低突变型疗效显著降低 慢性髓性白血病 CKITCKIT基因突变基因突变9 9、11、13、17外显子外显子 伊马替尼 （格列卫） 1 1、野生型疗效差野生型疗效差 2、突变型疗效显著增加突变型疗效显著增加 3、Exon11突变有效率最高突变有效率最高 PDGFRAPDGFRA基因突变基因
10、突变1212、18外显子外显子 1 1、野生型疗效差野生型疗效差 2、突变型疗效显著增加突变型疗效显著增加 3、Exon18中中D842V突变可能出现原突变可能出现原 发性耐药发性耐药 24 疾病疾病相关靶标基因相关靶标基因相关基因位点相关基因位点药物名称药物名称指导意义指导意义 肾细胞癌 PDGFRmRNAPDGFRmRNA表达表达PDGFRPDGFR 索拉菲尼 舒尼替尼 高表达患者能明显提高生存率高表达患者能明显提高生存率 VEGFR1/2mRNAVEGFR1/2mRNA 表达表达 VEGFR1/2VEGFR1/2高表达患者能明显提高生存率高表达患者能明显提高生存率 结直肠癌 VEGFmR
11、NAVEGFmRNA表达表达VEGFVEGF 贝伐单抗 高表达患者能明显提高生存率高表达患者能明显提高生存率 VEGFR1/2mRNAVEGFR1/2mRNA 表达表达 VEGFR1/2VEGFR1/2高表达患者能明显提高生存率高表达患者能明显提高生存率 乳腺癌 HER2HER2基因扩增基因扩增Her2Her2 曲妥珠单抗 （赫赛汀） 拉帕替尼 HERHER2 2基因高表达疗效好基因高表达疗效好，低表达疗效差低表达疗效差 PI3KCAPI3KCA基因突基因突 变变 9 9、20外显子外显子 PIKPIK3 3CACA基因野生型患者疗效较好；基因野生型患者疗效较好；PIK3CA基因突变性患者基因
12、突变性患者， 疗效显著降低疗效显著降低 非小细胞肺癌 EML4EML4- -ALKALK融合融合 基因基因 EML4EML4- -ALKALK 克唑替尼 ALKALK基因表达患者疗效较好基因表达患者疗效较好 慢性粒细胞白血病 ABLABL突变突变315315密码子密码子 格列卫 慢性粒细胞白血病患者中慢性粒细胞白血病患者中，ABL基因野生型患者疗效较好；基因野生型患者疗效较好； T315I 突变型患者突变型患者，疗效显著降低疗效显著降低 25 3.2 精准医疗计划 2015年奥巴马提出精准医疗 计划：精准医学赋予了我们 一个实现全新医学突破的伟 大机会，拯救生命的发现将 迎来新时代，而这一项目
13、将 为此奠定基础。 -精准医疗离不开精准检测 26 我的医疗选择安吉丽娜朱莉致纽约时报 时间：2013年5月14日 内容： 我是BRCA1基因携带者，这 种基因存在着缺陷，会导致 罹患乳腺癌和卵巢癌的风险 大幅提高。 做出接受乳房切除手术 这一决定并非易事。然而， 我很高兴自己做出了这样的 决定。现在，我的乳腺癌发 病率已经从87%降至5%以 下 朱莉效应 27 精准医疗概念 精准医疗是应用现代遗传技术，分子影像技术，生 物信息技术结合患者生活环境和临床数据实现精准 的治疗与诊断，制定具有个性化的疾病预防和治疗 方案。是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技 术快速进步以及生物信息与大数据科学的
14、交叉应用 而发展起来的新型医学概念与医疗模式 中国工程院院士詹启敏 28 精准医疗的作用 123 提高治疗的有效性降低药物的副作用节约医疗的费用 29 精准医学贯穿整个疾病预防和诊疗过程 预防诊断治疗 确定风险人 群，实现精 准预防 实现疾病的 早期诊断和 精确分类 优化治疗策略， 提高疗效、降 低副作用 提高 健康 水平 30 传统治疗模式：传统治疗模式：“反复探索反复探索”医学医学 观察观察诊断诊断治疗治疗 安全安全/ /毒性毒性 有效有效/ /无效无效 调整用药调整用药 观察观察诊断诊断治疗治疗 基因检测基因检测 安全有效安全有效 精准医疗模式：精准医疗模式：“量体裁衣量体裁衣”医学医学
15、 精准医疗模式 31 3.3 基因检测临床应用实例 HPV基因分型 遗传性耳聋基因检测 药物代谢基因检测 32 原理：核酸分子杂交是指两条DNA链或两条RNA链 或一条DNA链或一条RNA链按碱基互补的原则缔合成 异质双链的过程。 3.3.1HPV基因分型 33 HPV基因分型与相关疾病 扁平疣3、10、27、28、41 寻常疣1、2、4、7、27、29、40、54 疣状表皮发育不良 5、8、12、14、15、17、19、25 38、46、47、49、 50 尖锐湿疣 6、11、16、18、31、33、34、35、39、51、64- 68、70、73 鲍温样丘疹病16、18、39、42 宫颈上
16、皮内瘤 6、11、16、18、31、33、35、43、44、51、56、 58、61 浸润性宫颈癌 16、18、31、33、 35、39、45、51、52、56、58、 59、68 阴茎癌16、18 女阴癌16、18 34 耳聋 非综合征型（70%） 遗传因素（约60%） 常染色体隐性（80%） 环境因素（约20%） 综合征型（30%） Alport 综合征 Pendred综合征 Waardenburg综合征 BOR综合征 Usher综合征 等 细菌感染 病毒感染 耳毒性药物 外伤磕碰 声损伤 常染色体显性（15%-20%） 性连锁（ 1%） 线粒体 （ 1%） 不明原因（约20%） 很可能是 遗传因素 Journal of Audiology and Speech
