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1、连接和转化原理：隆技术（TA cloning）利用Taq聚合酶具有末端转移酶（TdT）活性，但却不具有3-5端外切酶校准活性的特点，可在PCR产物的3端加上一个非模板依赖碱基“A”。pMD18-T是一种高效克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在Xba I和Sal I识别位点间插入一个EcoR V位点，然后用EcoR V进行酶切使质粒线性化，并在它的3端添加“T”构建而成。因其3端带有一个突出的“T”尾，能高效地与带“A”尾的PCR产物连接，极大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR产物最简便、快捷的方法。pMD18-T载体结构图TA克隆原理图技术路线 送样要求1. 请提供克隆片
2、段的相关信息，包括名称、大小、样品是否带有“A”尾以及PCR产物是否已纯化。已纯化的PCR产物请确保使用的溶剂为灭菌的双蒸水。2. PCR已纯化样品：浓度20ng/l,体积20l；PCR未纯化样品：浓度50ng/l, 体积25l。所需DNA的总量会随片段大小的不同而有所变化。样品定量检测结果以我们为准。3. 请务必在订单上注明 PCR所用引物序列，以便用于克隆结果的核对分析。4. 当克隆结果中包含合作伙伴提供的单向部分引物序列，我们即视实验成功，将收取全额的实验费用。5. 若序列中包含高GC、Poly等特殊或复杂结构导致测序中断，我们即视实验成功，将收取全额的实验费用。6. 项目完成一个月后，
3、若合作伙伴无要求返还菌液或质粒等，则我们将代为销毁。提供结果1.高纯度质粒，大约2g DNA，OD值在1.80-2.00之间2.含有重组质粒的甘油菌3测序原始图谱和序列4.去载体后的序列5要求测通的样品则提供拼接序列。步骤一、 连接：T4连接前的准备。配LB培养基，每个培养皿（一次性）约20ml。配法（100ml）：胰蛋白栋1g；酵母浸粉0.5g；氯化钠0.5g；琼脂1.5g；加NaOH100l（0.01mol/L），调PH=5.8温而不烫时（即121灭菌后，待凝固前或重融）， 100微升加入60l的AMP（100mg/mL），然后铺板。T4连接： 目的片段 7l 载体 1l T4 DNase
4、 1l 加完后混匀，顺势离心 T4 buffer 1l16连接过夜（一般16h）转化：取感受态（-80冰箱，吊盒，每管100l），在冰上融化（1min左右），融化后，分出50l加到另一个预先冰浴的离心管中 将连接的10l产物与50l感受态混合，轻弹几下 冰浴5min 加入预先摇床的LB离心管液体培养基800l（应提前将冰箱中的LB在528摇床中摇融，每管1000l，直接吸出800l，用的时候取出） 37恒温摇菌1h 5000rmp离心1min，收集菌体 大约留100l上清液，并用枪头将上清液与菌体混合，此时需加入 lX-gal和 lIPTG混匀 涂板（涂在加AMP的LB培养皿中，每100l加6
5、0lAMP） 37恒温培养过夜。次日挑取白点（用10l的水溶），PCR验证，之后选取正确的菌点摇菌（测序剩下的9l菌液加到50ml离心管中加约10ml的LB液体培养基（AMP抗性）37摇菌过夜）测序并保存（500l菌液+500l甘油，液氮速冻，80保存）。二、 过表达载体的构建（NdeI、SalI）提前准备含AMP、KAN抗性的LB液体和含KAN抗性的固体LB。1、 将含正确序列的大肠杆菌进行摇菌（AMP抗性）提质粒，同时含有pRI201-AN（kan抗性）载体的菌也提质粒。2、 两种质粒分别进行双酶切（NdeI、SalI），跑胶检测并胶回收，双酶切体系，20l 质粒 15l（2纳克即可） 1
6、0H Buffer 2l NdeI 1l 37恒温4h SalI 1l 水 1l3、 目的片段与pRI201-AN载体连接连接体系，10lT4 DNA Polymernase 1lT4 DNA Poly Buffer 1l 混匀，顺式离心，16 水 1l 恒温16hpRI201-AN载体与目的片段 共7l 大片段：小片段=3:18:1pRI201-AN大小 bp，目的基因大小1520bp。（小片段浓度/小片段大小）/（大片段浓度/大片段大小）=38:1。4、 转化：取感受态（每管100l），在冰上在冰上融化（1min左右），融化后，分出50l加到另一个预先冰浴的离心管中 将连接的10l产物与50l感受态混合，轻弹几下（新的离心管要提前冰浴） 冰浴30min 42水浴90s（需准时）冰浴5min 加入预先摇床的LB离心管液体培养基800l（应提前将冰箱中的LB在528摇床中摇融，每管1000l，直接吸出800l，用的时候取出） 37恒温摇菌1h 5000rmp离心1min，收集菌体 大约留100l上清液，并用枪头将上清液与菌体混合 涂板（涂在加AMP的LB培养皿中，每100l加60lAMP） 37恒温培养过夜。
