膜蛋白研究的里程碑资料

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1、 进 展 第 49 卷 第 5 期 2004 年 3 月 403 膜蛋白研究的里程碑 2003 年诺贝尔化学奖 赵文龙 隋森芳* (清华大学生物科学与技术系，生物膜国家重点实验室，北京 100084. * 联系人，E-mail: suisf ) 2003 年 10 月, 诺贝尔化学奖颁给了两位生物学 家, 美国约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University) 医学院的 Peter Agre 和洛克菲勒大学(Rockefeller Uni- versity)休斯医学研究所(Howard Hughes Medical In- stitute)的 Roderick Mackinn

2、on, 以表彰他们“在膜通 道研究领域上的一系列开创性的工作”. Agre 的主要 贡献是发现了细胞膜上水通道的存在; 而 Mackinnon 的主要贡献则是通过解析钾离子通道的三维空间结 构阐明了该离子通道的机制. 1 水通道(Aquaporins)的发现 水是生物体的主要组分, 生物体细胞吸收和释 放水分是一个基本的生命现象. 长期以来, 关于水分 子如何穿过细胞膜一直存在着争议. 最早, 认为水分 子是以自由扩散的形式透过细胞膜的, 然而许多实 验室观察到了与此观点不太一致的一系列现象. 红 细胞膜对水分子的通透率(permeability)比其他许多 细胞和人工脂双层要高很多; 而且该

3、过程的自由能 很低, 只有 21 kJ/mol, 相当于在溶液环境中自由扩散. 用HgCl2和一些有机汞试剂可以可逆地抑制这一过程, 提示了水分子的跨膜运输与蛋白质相关. 更进一步 的证据来自某些上皮组织, 它们在显示出对水通透 性的变化的同时, 脂类分子的组成和含量却没有改 变. 这些事实逐渐使人们意识到, 在细胞膜上一定存 在着专门运输水分子的通道, 这个通道对水有很高 的通透效率. 然而由于水分子的通道蛋白一直没有 被分离出来, 加上脂双层膜本身对水有一定的通透 性, 所以水通道的存在性曾广受质疑1. 直到 20 世纪 80 年代末, 一次偶然的机会, Agre 发现了水通道. 他在分离

4、Rh血型抗原中的 32 kD大小 的整合膜蛋白时, 得到了一个 28 kD的肽段. 起初认 为是Rh抗原裂解的小片段, 后来他发现这是一种新 的蛋白, 这种蛋白主要分布在红细胞和肾小管细胞 中, 并且以非糖基化的 28 kD和N-糖基化的 40 60 kD两种形式存在2. 通过序列的比较表明3, 它与一 组可能具有膜通道功能的蛋白很相似. 与此同时, 另 外一个独立的研究小组通过放射性失活研究肾脏的 水通透变化, 最后把目标指向一个大约为 30 kD大小 的蛋白4. 由于该蛋白的特征性的组织分布, Agre开 始意识到这个蛋白可能就是长期以来一直寻找的水 通道蛋白. 这个蛋白现在被称作aqua

5、porin1(AQP1). Agre设 计了巧妙的实验, 在水通透性非常低的非洲爪蟾 (Xenopus laevis)卵中验证了AQP1 的水通道蛋白的功 能. 当爪蟾卵中注射有体外转录的AQP1 RNA后, 对 水的通透性迅速升高, 将其置于低浓度外界溶液中 时, 体积膨胀变形, 这一过程可被Hg2+可逆抑制5. 体外实验也支持这一结论, 把高纯度的AQP1 重组到 脂质体上后, 脂质体对水的通透性提高了 50 倍以上, 达到每个亚基每秒钟可以通过大约 3109个水分子, 而对质子和尿素的通透性并没有提高6. 更加直接的 证据来自van Hoek, 他把除AQP1 以外的其他蛋白去 除掉以后

6、, 红细胞仍然具有很高的水通透性7. 至此, 关于水通道存在性的争论告一段落. 目前的观点是 细胞膜的脂双层可以透过一定量的水分子, 但要使 水分子高效地透过细胞膜, 必须要水通道的参与. AQP1 以四聚体的形式存在于细胞膜中, 每个亚 基都能形成功能上独立的孔道8. 序列分析表明, 它 是一个 6 次跨膜的蛋白, N-端和C-端序列相似, 各具 有一个保守的特征性序列Asn-Pro-Ala(NPA)3(图 1). AQP1 具有 4 个半胱氨酸, 但突变研究表明, 仅仅一 个(Cys-189)对汞离子敏感, 这个半胱氨酸靠近NPA 序列, 位于水通道的孔道内8. Agre通过重组技术在 A

7、QP1 上引入特异性的酶切位点, 并用酶切分析揭示 了它的拓扑学结构10, 据此提出 “砂漏模型(hourglass model)” . 这个模型认为：两个分别位于N-端和C-端包 含NPA序列的螺旋从膜内外两侧朝膜中央伸展而重叠, 并形成一个被 6 次跨膜的螺旋所包围的孔道11. 这个 模型是生化上对AQP1 结构认识的一个总结. 由于肾脏与水的重吸收息息相关, 人们把分离 水通道家族其他蛋白的目标指向了肾脏. 不久, 第 49 卷 第 5 期 2004 年 3 月 进 展 图 1 AQP1 拓扑结构模式图 从图中可以看出, 水通道每个亚基有 6 个跨膜螺旋(H1H6)及 2 个短螺旋(HB

8、和HE). NPA序列就位于短螺旋的顶端. 灰色圆圈表示结构上比较重要的氨基酸9 AQP2, AQP3, AQP4 等相继被分离出来. 到目前为止, 在人体内至少鉴定出 11 种水通道蛋白, 分布不再局 限于肾脏, 在脑、眼、肝脏、唾液腺等其他器官中都 发现了它们的存在12. 它们大体上可以分为两类: 一类是传统的水通道(classic aquaporins), 只选择性 地透过水分子; 另一类则称为甘油水通道(aquagly- ceroporins), 可以让水和甘油等其他一些小分子通过. 这些水通道与许多人体疾病相关, AQP0 基因突变可 以引起先天性白内障(congenital cat

9、aracts)13, AQP2 基因突变则使得肾收集管重吸收功能受损, 从而导 致肾性尿崩症(nephrogenic diabetes insipidus, NDI)14. 水通道具有很强的选择性, 它可以让水分子穿 过, 但对溶液里的阳离子和阴离子, 尤其是水合质子 却没有通透性. 这个问题长期困扰着人们, 因为形成 连续氢键的水分子可以以跳跃的方式极快地运输质 子, 就好像电子通过铜导线. 水通道是如何快速运输 水分子, 而不让质子通过的呢? 近年来, 通过电子晶 体 学 (electron crystallography) 和 X 射 线 衍 射 技 术 (X-ray crystallo

10、graphy)获得了水通道的高分辨率的三 维结构9,15, 再加上分子动态模拟(molecular dynamics simulation)的方法16,17, 水通道的选择性运输机制才 得以初步阐明. 每个水通道蛋白亚基具有一个砂漏状的孔道, 长度为 20 . 整个孔道侧壁主要由疏水性氨基酸围 成, 但也提供了 4 个亲水的位点, 利于水分子结合, 以降低水分子穿过孔道时的能量障碍. 这两种因素 达成一种巧妙的平衡, 保证了水通道对水的极高的 通透率和选择性15. 在孔道中点上方 8 处, 直径最 为狭窄, 此处可以通过大小限制(size restriction)和静 电排斥作用(electr

11、ostatic repulsion)来选择水分子. 最 窄处主要由精氨酸(Arg-195)和组氨酸(His-180)的侧 链围成, 直径2.8 , 与水分子的范德华半径相似, 可 以滤掉比水分子半径大的分子. 同时, 由于精氨酸 (Arg-195)和组氨酸(His-180)在生理条件下都带有正 电荷, 可以排斥阳离子, 紧密结合阴离子, 使它们无 法穿过水通道. 在水通道里, 最引人注目的是NPA的 特征性序列, 它在所有的水通道中都存在. 两个 NPA序列结构通过范德华力并排地结合在孔道的中 点处, 两个短的-螺旋与NPA序列相连, 且N末端朝 向孔道, 使得NPA上的天冬酰氨带上部分正电荷

12、. 目 前认为穿过水通道的水分子在此处与两个天冬酰氨 形成临时氢键, 从而发生极性翻转(water dipole reorientation)水分子进入孔道的胞外侧时氧原子 朝下, 在到达胞质侧时氧原子变成朝上(图 2), 其结 果是打破水分子之间形成的连续氢键, 阻断质子 运输9. 404 进 展 第 49 卷 第 5 期 2004 年 3 月 图 2 水通道选择通透机制 水分子在孔道中点处, 与两个天冬酰氨形成暂时的氢键, 发生极性翻 转9, 从而打断连续氢键 2 钾离子通道(potassium channels)机制的 阐明 钾通道的研究历史就比较久了, 大约在 50 年前, Hodgk

13、in和Huxley(1963 年诺贝尔生理学和医学奖得 主)就阐明了神经的动作电位(action potential)机制, 指出神经细胞膜顺序性的对钠和钾离子通透性的升 高是产生动作电位的原因. 这实际上就暗示了具有 选择透性的离子通道(ion channels)的存在. 到了 80 年代, 各种电压门控离子通道的 亚基相继被克隆出 来18. 钠离子和钙离子通道的序列表明, 它们具有 4 个同源重复的 6 次跨膜(分别为S1S6)结构域. 钾离 子通道稍晚才得以克隆, 它的序列长度只有钠通道 的四分之一, 仅具有一个 6 次跨膜的结构域. 因此, 钾通道应该是以同源四聚体(homotetra

14、mer)的形式存 在. 这一点后来被Mackinnon用化学计量法证明19. 电压门控钾通道的 6 个跨膜区中(图 3(a), S1 S4 被认为是感受电压的部位, 尤其是S4, 分布着带 正电的氨基酸. 其中前 4 个精氨酸构成主要的感受部 位21, 在电场的作用下, 可以在膜的两侧移动以控制 通道的开闭22. S5 和S6 是钾离子选择性通透的部位, 它们之间的短的孔道螺旋(pore helix)和非常保守的 特征性序列(signature sequence)在执行选择性的功能 上起重要作用23. 然而并不是所有的钾通道都是6次 跨膜, 还有一类钾通道 2 次跨膜, 序列分析结果显示, 这

15、类钾通道的两个跨膜区与电压门控的钾通道的S5 和S6 是同源的, 且具有相同的功能. 长期以来, 人们通过电生理、生物物理、突变等 多种手段对这些分子的通透机制等进行了大量的研 究, 在钾离子通道不同功能区的定位方面取得了长 足的进展, 到了 90 年代中期, 钾离子通道的选择性 功能已经定位到通道的外侧一个保守性非常强的区 域. 然而, 只有通过分析原子分辨率的结构, 才能真 正地了解钾离子通道的选择性通透机制、 打开和关闭 通道即门控机制以及电压感受机制等一系列基本问 题. 由于钾离子通道原子水平的三维结构一直无法 取得, 人们对这些基本问题的理解仍十分有限. 直到 1998 年, Rod

16、erick Mackinnon才成功解出第 一个高分辨率的离子通道三维空间结构源自链 霉 菌 Streptomyces lividans的 KcsA 钾 离 子 通 道 (图 3(a)23, 这个结构一定程度上解释了钾离子通道的 选择性通透机制. KcsA每个亚基具有两个跨膜区和 一个短的孔道螺旋, 其中一个跨膜螺旋靠近中央孔 道(内螺旋, inner helix) , 另一个与膜脂相邻(外螺旋, outer helix). 内螺旋与膜垂直方向形成 25 左右的夹 角, 且轻度扭结. 4 个亚基围成一个横跨细胞膜的孔 道, 孔道在细胞膜的外侧部分是由特征性序列所组 成的选择性过滤器(selectivity filter), 孔径狭窄，孔道 的其他部分则比较宽, 在通道中央形成一个直径为 10 的中央腔(central cavity). 靠近细胞膜的胞质一 侧, 4 个内螺旋末端形成束状. 除了Kcs