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1、高分辨率的“受激发射显微镜”(Super-resolution microscopy)Imaging chromophores with undetectable fluorescence by stimulated emission microscopy 要在衍射极限之外成像(比如说为了观测细胞中的微小结构),研究人员迄今为止必需依赖于用荧光发色团对成像目标进行标记,或依赖于不利用荧光、但灵敏度也要差得多的其他显微镜技术。现在,来自哈佛大学化学与化学生物学系的一个小组开发出了另外一种技术,被称为“受激发射显微镜”,它结合了以前用在其他多光子显微镜中的实验技术。该方法的灵敏度在包括无标记微管成
2、像和用一个“chromogenic reporter”来监测lacZ基因表达的应用中得到展示。该方法的灵敏度比吸收方法高几个数量级,不受样品中其他发色团的干扰,而且适用于三维切片观测。重要的是,所有分子都是“受激发射显微镜”的潜在观测目标,所以它可用来对不发荧光的物质进行成像观测,如血红蛋白,这些物质以前用超高分辨率的显微镜无法观测。(Letter p. 1105; News & Views),第十二章 细胞核,THE CELL NUCLEUS,1781年 Trontana发现于鱼类细胞; 1831年,Brown发现于植物。 大小:植物14m,动物10m。正常细胞核质比NP0.5,分裂期细胞N
3、P0.5,衰老细胞NP0.5。,形状:圆形,胚乳 (网状)、蝶类丝腺 (分支状)。 位置:细胞中央 ,成熟植物细胞的边缘。 数目:通常一个,成熟的筛管和哺乳动物红细胞(0)、肝细胞、心肌细胞(1-2)、破骨细胞(650)、骨骼肌细胞(数百)、植物毡绒层细胞(24)。,Nucleus structure,结构:核被膜、核仁、核基质、染色质、核纤层。 功能:遗传、发育。,第一节 核被膜,Nuclear envelope,一、核被膜是双层膜结构,外核膜:来源于内质网,附有核糖体。 核周隙:宽2040nm,与ER腔相通。 核纤层:内核膜内表面的纤维网络,支持核膜,并与染色质、核骨架相连。,The nu
4、clear envelope,核纤层由核纤肽构成,属IF,分A、B两型。 作用: 1保持核的形态: 2参与染色质和核的组装:M期核纤层被磷酸化,核膜解体。B型核纤肽与核膜残余小泡结合,A型溶于胞质。分裂末期,核纤肽去磷酸化重新组装,介导核膜重建。,The structure of lamin,Lamins,二、核孔是物质运输的通道,由至少50种不同的pr构成,称为核孔复合体(nuclear pore complex,NPC)。 一般哺乳动物细胞约3000个核孔。 电镜下观察核孔呈圆形或八角形,一般认为其结构如fish-trap。,Cytoplasmic face cytoplasmic par
5、ticles,Nuclear face basket inner complex,The Nuclear Pore,三、通过核孔的物质运输与信号序列有关,核定位信号(NLS):引导蛋白进入细胞核,受体为importin,4-8个氨基酸组成,含Pro、Lys和Arg。完成核输入后不被切除。 第一个被确定的NLS是病毒SV40的T抗原,其NLS为: Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val,核输出信号(NES),引导RNP输出细胞核,受体为exportin。 Ran蛋白,属G蛋白,调节货物复合体的解体或形成。 蛋白输入过程参见下图:,Process of Nuclear Im
6、port,Colloidal gold labeled Nucleoplasmin were transported into nucleus.,Mitochondrion,第二节 染色体,1848年,Hofmeister发现于鸭跖草的小孢子母细胞。 1879年,Flemming提出Chromatin。 1888年,Waldeyer提出Chromosome。,一、染色质的化学组成,组成:DNA、组蛋白、非组蛋白、少量RNA。 比例:1:1:(1-1.5):0.05。,(一)DNA,3种序列:单一序列;中度重复序列(1015);高度重复序列(105)。 3种构像:B-DNA、Z-DNA、A-DN
7、A。 3种基本元素:自主复制序列(ARS);着丝粒序列(CEN) ;端粒序列(TEL)。 YAC 与BAC:含上述3种成分,用于转基因。,THREE DNA CONFORMATIONS,THREE KEY REGIONS OF A CHROMOSOME,(二)组蛋白,带正电荷,含Arg,Lys,属碱性蛋白,共5种,分为: 核心组蛋白(core histone):H2A、H2B、H3、H4; 连接组蛋白(linker histone):H1。,结构:高度保守,尤其是H4。 核心组蛋白由球形部和尾部构成,球形部借Arg与磷酸二脂骨架间的静电作用使DNA分子缠绕在组蛋白核心上,形成核小体,尾部含有大
8、量Arg和Lys,为转译后修饰的部位。 H1多样性,具有属和组织特异性。,(三)非组蛋白,序列特异性DNA结合蛋白。特性: 带负电,属酸性蛋白。 整个细胞周期都合成,组蛋白只在S期合成。 能识别特异DNA序列,结合籍氢键和离子键。 功能:帮助DNA折叠、复制;调节基因表达。,二、从DNA到染色体,核小体(nucleosome):一种串珠状结构,由核心颗粒和连结线DNA两部分组成,通过酶消化实验建立。 核小体单位包括约200bp的DNA、一个组蛋白核心和一个H1。,由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体,构成核心颗粒; DNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面,每圈80bp,共1.75圈,
9、约146bp,两端被H1锁合;,相邻核心颗粒之间为一段60bp的连接线DNA。,在低盐亲水介质中展开的染色质,示串珠状的核小体(JA,Gall 1981),通过核小体长度压缩7倍,形成11nm纤维。 电镜下观察用温和方法分离的染色质是直径30nm的纤维,有两种解释:由核小体螺旋化形成,每6个核小体绕一圈,长度压缩6倍;由核小体纤维Z字形折叠而成,长度压缩40倍。,solenoid,对更高级染色体包装方式,至今尚不明确。 目前多认为30nm的纤维折叠为一系列的环(loop)结合在核骨架上(或称染色体骨架),结合点是富含AT的区域 。,Chromatin Packing,Chromatin Pac
10、king,Nucleoid spread with 2 long axes made up of bundles of fibres,Radial loops of chromatin in undisrupted chromosomes,human chromosome 2,三、异染色质和常染色质,常染色质是具有转录活性的染色质,结构疏松,电子密度低。 异染色质的特点: 凝缩状态,无转录活性、是遗传惰性区。 在细胞周期中表现为晚复制、早凝缩。 分为两类:结构异染色质、兼性异染色质,雌性哺乳动物细胞中一条异固缩化的X染色体。 人胚胎发育16天后出现巴氏小体。,barr body,巴氏小体,四、
11、染色体,一、染色体相关的术语,核仁组织区(NORs) 构成核仁,位于染色体的次缢痕区,但并非所有的次缢痕都是NORs。,How a nucleolus is organized,端粒(telomere):由高度重复的短序列组成。 作用: 维持染色体稳定性。 起细胞分裂计时器的作用。DNA每复制一次端粒减少50100bp。,(二)染色体的数目,性细胞染色体为单倍体,用n表示; 体细胞为2倍体,以2n表示,还有一些物种的染色体成倍增加成为4n、6n、8n等,称为多倍体。 染色体的数目因物种而异。,(三) 着丝粒的结构,着丝粒(centromere)和着丝点(kinetochore)是两个不同的概念
12、。 着丝粒包含3个结构域: 1. 着丝点结构域(kinetochore domain) 位于着丝粒的表面,包括三层板状结构和围绕外层的纤维冠(fibrous corona)。,2 . 中央结构域 位于着丝粒结构域的下方,含卫星DNA。 3 . 配对结构域 位于着丝粒内层,中期连结染色单体。 4 . 着丝点蛋白 用ACAs发现的着丝粒蛋白主要有6种(CENP A-F),OP,interzone,IP,Satellite DNA (FISH image),Proteins associated with the centromere have been identified using antib
13、odies from scleroderma patients CENP proteins CENP-A centromere-specific histone CENP-B binds central domain satellite DNA CENP-C binds kinetochore CENP-D binds kinetochore CENP-E kinesin-like motor, involved in chromatid segregation CENP-F binds kinetochore INCENP proteins INCENP-A sister chromatid
14、 association INCENP-B sister chromatid association,Centromeric proteins,(四)核型与带型,1. 核型:物种中期染色体特征的总和(染色体数目、大小、形态)。 2. 带型:染色体经理化因素处理后染色,呈现稳定的带纹(band)。 分带技术分两类:一类是产生的染色带分布在整过染色体的长度上如:Q、G和R带,另一类是局部性的显带,如C、Cd、T和N带。,(五)几类的特殊的染色体,1. 多线染色体: Balbiani(1881)发现于摇蚊幼虫唾腺细胞,特点: 体积巨大,是由于核内有丝分裂的结果; 多线性; 体细胞联会; 横带纹; 膨
15、突和环。在幼虫发育的某个阶段,多线染色体的某些带区疏松膨大,形成膨突(puff),或巴氏环(Balbiani ring)。用H3-UdR处理细胞,发现膨突被标记,说明膨突是基因活跃转录的区域。,Polytene chromosomes,2. 灯刷染色体 见于鱼类、两栖类、爬行类双线期卵母细胞,双线期是卵黄合成的旺盛期。染色体主轴两侧有侧环,状如灯刷,故名。侧环是转录活跃的区域。 3 . B染色体 Randolph (1928 )把生物的正常染色体叫做A染色体,把形态和行为不同为A染色体的超数染色体称B染色体。,(六) 间期染色体,非随机分布,不同染色体具有各自的分布域,称为染色体域(chrom
16、osome territory)。 基因密度高的染色体(如19号)分布于核中心,基因密度低的(如18号)分布于核的周边区域。 同一染色体上,活动染色质可能位于细胞核的中心、远着丝点区域、或形成疏松的环状结构。,(a) 12号染色体红色; 14号黄色; 15号绿色,(注意同源染色体的分布); (b,c) 12 号染色体绿色, 14号红色 ,15号蓝色; (d)染色体域模式图,小鼠淋巴细胞染色体的空间分布(LA. Parada 和T Misteli 2002),第三节 核仁,间期细胞核内呈圆球形的结构,一般12个。功能是转录rRNA和组装核糖体亚单位。 蛋白合成旺盛和分裂增殖较快的细胞有较大和较多的核仁,反之核仁很小或缺如。 核仁在分裂前期消失,末期又重新出现。,一、核仁形态,纤维中心:是致密纤维包围的低电子密度的圆形结构,主要成分为RNA聚合酶和rDNA。 致密纤维组分:呈环形或半月形包围FC,由致密纤维构成,是新合成的RNP。 颗粒组分:由直径15-20 nm的颗粒构成,是不同加