绿色荧光蛋白(gfp)原核表达分析

2、理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。1.2 实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分

3、子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。同时也正因为其荧光反应不是

4、酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特

5、性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。1.3 流程图：2材料与方法2.1材料2.1.1实验材料质粒DNA;PCR产物、酶切质粒、DNA Marker;外源DNA片段：PCR扩增回收目的片段A和PGM-Tvector(Amp,lacZ),带限制性内切酶末端的DNA溶液（目的片段A和载体片段pBL）;E.coli DH

6、-5受体菌（R-M-），自提的质粒或重组子;重组质粒DNA的菌落、BL21;重组GFP质粒、标准蛋白。2.1.2实验仪器 PCR仪、PCR管、移液枪、离心机、电泳仪、涡旋振荡器、冰箱、透射仪、紫外透射仪、刀片、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、Eppendorf管、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、振荡培养箱、移液器、摇床、酒精灯、培养皿、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、分光光度计。2.1.3实验试剂模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、Buffer(内含Mg2+)、ddH2O、pGM-T载体、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒，其它生化试剂皆为国产分析

7、纯。2.2实验方法2.2.1 PCR扩增目的基因片段(1) 依次混匀下列试剂，反应体系如下：PCR反应体系各成分的量ddH2O 9.5 ml上游引物 1.0 ml下游引物 1.0 ml模板DNA 1.0 mlTaqDNA聚合酶12.5 mlTotal 25 ml 混匀后瞬时离心(2)将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。预变性94 3 min，变性94 30s，退火52 30s，延伸72 40s 30个循环。总延伸72 4 min；温度时间预变性943min变性9430S退火5230S延伸7240S总延伸72240S(3)PCR扩增完毕后，取出PCR管放在冰盒上；(4)取5ml

8、扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。2.2.2目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳检测（1）加20ml 1TAE缓冲液于三角瓶中；（2）精确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化；（3）冷却至60左右，加1l的Goldview溶液，摇匀；（4）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上；（5）轻轻拔除梳子，将胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE），使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm；（6）取5l质粒DNA及2l加样缓冲液混匀上样；（7）110v约电泳0.51小时；（8）紫外透射仪观察结果。2.2.3 DNA的回收和纯化回收PCR产物（采用天根时代DNA回收试剂盒）:（1

9、）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，分别放入1.5ml离心管中；（2）以0.1g凝胶对应300l的体积加入PN;（3）50水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解；（4）将上述的得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，12000rpm离心60s，弃掉废液；（5）加入700l漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；（6）加入500l漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；（7）将离心吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min；（8）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适当的洗脱缓冲液EB 30l，洗脱缓冲液先在

10、65水浴预热，冷却至室温，12000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，12000rpm离心1min；（9）电泳检测回收产物，余置于-20下保存。透射仪观察结果，并拍照。2.2.4重组质粒的连接把PCR扩增的目的基因片段产物与pGM-T载体连接，反应体系如下：体系成分体积(L)ddH2O3.510T4 DNA1.0目的片段（回收）4.0pGM-T载体0.5T4 DNA ligase1.0Total10.02.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备采用CaCl2法。（1）将实验室保存的E.coli DH-5菌株甘油管用无菌去离子水1:100稀释后，平板划线

11、法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37、200rpm震荡培养过夜，活化E.coli DH-5菌株；（2）按照1%接种量，从上述培养液中吸取菌液2ml，转瓶接入200ml新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37,200rpm震荡培养至OD600值为0.5左右；（3）在已灭菌的10ml离心管中吸取上述培养液10ml，冰水浴10min后，4、6000rpm离心2min，收集菌体，弃上清；（4）加2ml冰冷预热的0.1mol/LCacl2溶液，重悬菌体，冰浴10min，4、6000rpm离心2mi

12、n，收集菌体，弃上清；（5）将每一份沉淀轻缓地悬于0.41ml含有20%甘油的0.1mol/L Cacl2的溶液中，轻轻重悬菌体沉淀，冰上放置10分钟；（6）分装100L/管（冰浴分装），置于-70冰箱中保存。2.2.6连接产物转化感受态细胞(1)转化用固体LB培养基平板制备：向含100g/ml氨苄青霉素（AMP）的固体LB培养基平板上加50mg/ml的IPTG16l和20mg/ml的X-gal 40L，用灭菌弯头玻璃棒涂布均匀，37避光倒置3h，让溶解X-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。加入ITPG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。（2）连接产物转化E.coli DH-

13、5感受态细胞：取5l连接产物加到100l E.coli DH-5感受态细胞中。轻弹混匀，水浴20min。取出离心管，42 水浴中热激90 后，立即置冰浴中冷却5min。向离心管中加入800L 37预热的无抗生素的LB液体培养基。取出离心管，12000rpm离心2min，弃上清800L，用剩余的约100L上清将沉淀菌体吸打混匀后，在LB平板上涂布ITPG和X-gal。将平板倒置在37恒温箱中培养14h18h，直至长出菌落，观察结果。2.2.7重组质粒的菌落鉴定本次实验所用的pGM-T vector 含Ampr、lacZ基因，所以有重组质粒的菌落为白色，没有重组质粒的菌落为蓝色。具体操作如下：挑取

14、菌落：使用无菌枪头随即挑取5个白色菌落，放入含氨苄青霉素的LB液体培养基的1.5ml EP管，振荡培养4h以上，吸取0.5ul菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。PCR反应体系与反应程序均与目的基因扩增条件一致。扩增产物取5ul用1%琼脂糖凝胶进行检测。2.2.8提取重组质粒将鉴定为阳性重组子的质粒EP管挑取出来，按照实验室提取质粒的试剂盒说明书操作。提取后，取5ul用1%琼脂糖凝胶进行检测。2.2.9重组质粒双酶切用限制性内切核酸酶BamH和Sal对PCR阳性菌落提取的质粒做双酶切鉴定。酶切反应体系如下表。体系成分体积质粒5.0ul去离子水11ul10Buffer T3.0ulBamH（120U/ul）0.5ulSal(100U/ul)0.5ul总体积20ul37酶切过夜，70灭活酶活性。1%琼脂糖凝胶进行检测。2.2.10 GFP基因重组表达质粒及诱导表达（1）将上步经酶切鉴定得到的GFP目的片段与表达质粒连接，并转化至大肠杆菌BL21菌株。转化菌涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37过夜培养；（2）观察菌落生长情况，进行菌落PCR鉴定；（3）将鉴定为阳性的菌落接种于20ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37

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