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1、细胞培养中污染物的预防与清除,丁小燕 中科院上海生化细胞所 2016，Jan，22-24,中国科学院生物 遗传资源评价与组学应用技术 培训班,（科学院对我们的要求）, 十八大明确提出要“实施创新驱动发展战略，强调科技创新是提高社会生产力和综合国力的战略支撑，必须摆在国家发展全局的核心位置”。 我国科技服务业已经具备一定的发展基础，但是与英、美等发达国家相比，我国的科技服务业产值及其占GDP比重较低，2011年度实现科技服务增加值不足7000亿元，占GDP比重约为1.4%。 2014年10月，国务院印发关于加快科技服务业发展的若干意见（国发201449号），这是国务院首次对科技服务业发展作出的全
2、面部署。,用创新驱动科技服务业的发展,（国家对我们的要求）,细胞资源为生物医药基础研究和产业发展提供支撑和保障,细胞资源保藏和技术研发,人类遗传资源库,基础研究实验细胞库,国家发展和安全战略,一， 细胞系是重要的遗传资源。细胞库的功能包括资源保藏能力、资源利用能力和资源开发能力。这三方面的提升是建设一流细胞保藏单位的关键抓手，也是推动细胞库向科技服务业转移重心的必经之路。 二， 保证细胞株不受污染是细胞库保藏能力的关键性标志，也是其他能力提升的基础。,一， 细胞系是重要的遗传资源。由细胞库（Cell Bank）负责保存细胞系。,一， 细胞系是重要的遗传资源。负责保存细胞系的细胞库应当开发、承担
3、更多的功能，提升服务科技、服务社会的能力，产生更高的服务业产值。,一， 细胞系是重要的遗传资源。保存细胞系的细胞库其功能包括资源保藏能力、资源利用能力和资源开发能力。这三方面的提升是建设一流细胞保藏单位的关键抓手。,坚持国际接轨的细胞保藏技术水平，积极吸引国内有知识产权的细胞系进入细胞库保藏，逐步形成自己的特色。,坚持用户至上的服务态度，全方位为用户着想为用户服务，积极推动库内细胞资源的利用。,密切关注国际细胞生物学发展前沿，主动与医院等单位合作，拓宽细胞资源的种类，为我国细胞生物学的进一步发展做好准备。,我们的目标,二，污染是细胞培养的大敌。保证细胞株不受污染是细胞库保藏能力的关键性标志，也
4、是其他能力提升的基础,1，细菌污染 2，真菌污染 3，支原体污染 4，内毒素污染 5，细胞间交叉污染,1，细菌污染。 实验室中因操作不慎而引起的污染，即使在细胞培养液中加入了预防剂量的抗菌素也会产生。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌，以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成实验失败和细胞株(系)丢失。,2，真菌污染 在细胞培养过程中较为常见，尤其在南方霉雨季节进行细胞培养更易产生。最常见的真
5、菌有：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色小点，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。,3，支原体污染 3.1，支原体污染是目前实验室中最为常见的污染细胞的原核生物。 因支原体属于直径介于0.2左右的最小原核生物，形态易变，故极易通过滤膜而逃过培养液的过滤除菌步骤。在细胞培养液中，支原体可达到107-108CFU/mL （CFU=Colony Forming Unit，支原体浓度测量单位）而不使培养液混浊及影响细胞生长。
6、多种支原体对细胞不产生任何病变效应，使得细胞污染不易被察觉。据报道，目前世界上有30-50%的细胞株已受支原体污染。但是支原体对干细胞培养的影响甚大，胚胎干细胞受支原体污染形态、生长速度等均出现改变。 在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。,由于多数细胞受支原体污染后无明显变化或略有变化，若不及时处理，将产生交叉污染。另外，支原体会改变宿主细胞的结构和功能等一系列特征，因此尽管很多受支原体污染的细胞其形态看不出变化，但对其进行进一步分子生物学分析时，其实验结果会不准确。为此建议各实验室定期对细胞进行支原体检查。 可污染细胞的支
7、原体种类较多，主要有Mycoplasma orale, M.hyorhinis, M.arginini 和 Acholeplasma laidlawii。目前已发现的支原体超过100种，这就是单一的检测方法有时会失败的原因之一。我们建议至少选择2种方法来检测支原体。,3.2，常用支原体检测方法 3.2.1，肉汤培养基检测法。医药行业规定使用。 3.2.2，间接染色法检测支原体 用待检测的细胞培液培养Vero细胞，然后用显微镜观察是否有支原体感染。Vero细胞来源于正常的成年非洲绿猴肾组织，由Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年在日本Chiba大学分离得到。Vero细胞是非
8、整倍体，可在培养液中无限生长，常用来生产疫苗，检测支原体和细菌外毒素等。细胞培养液中的支原体可用Hoechst33258或DAPI染色后观察到。由于支原体含有DNA，染色后在细胞表面，培养基中及培养皿表面呈现出荧光小点。,间接染色法检测支原体,3.2.2，PCR法检测支原体 许多支原体检测方法不仅用时长而且复杂，有的方法仅限于检测有限种类的支原体。PCR检测法灵敏度高，特异性强，只用一天时间即可快速检测细胞培养液中的支原体，是一种检测支原体的有效手段。中科院干细胞库选择支原体16S rDNA序列为靶序列设计引物，同时做对照组实验和干扰实验以避免假阳性或假阴性结果，取得了很好的效果。,PCR法检
9、测支原体,预防： 1.支原体喷雾（品牌：Biochrom )： 喷于操作台和培养箱 2.Plasmocin prophylactic （品牌：InvivoGen）： 作用浓度为 5g/ml 作用于常规的 细胞培养基（ 500x 稀释） 去除： Plasmocin treatment（品牌：InvivoGen）： 作用浓度为 25g/ml ，作用于感染的培养 细胞基两周（ 1000x 稀释）。,3.3，支原体污染的预防和去除,4.1， 细菌内毒素对培养物的危害： 实验证明，细菌内毒素对培养细胞（尤其是ES细胞）的生长及活性具有明显的抑制作用,且该作用具有一定的时间、剂量依赖性。 4.2，细胞培养
10、中内毒素的来源： 细胞培养基中的主要天然成份-牛血清包括胎牛血清和新生牛血清是内毒素的潜在来源。我国2000年版中国生物制品主要原辅料质控标准中对牛血清提出比较严格的标准要求。包括蛋白质含量，细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素，支持细胞增殖检查等等。对于胚胎干细胞培养，LIF和bFGF是细菌内毒素的另一个潜在来源。,4，内毒素污染,4.3，细胞培养中内毒素的监控： 为排除血清、LIF和bFGF中内毒素的污染，细菌内毒素检测是非常重要的。中国科学院干细胞库只使用细菌内毒素小于1EU/ml的血清、LIF和bFGF等各种生长因子。 4.4，内毒素监控是细胞用于临床治疗所必须的。
11、目前各类临床级干细胞尚无统一的国际、国内标准，这是胚胎干细胞进入实际应用阶段的最大障碍之一，也是细胞库水平的一个重要标志。但是在制药工业中内毒素是必须去除的。因此，中国科学院干细胞库强调高标准严要求，把内毒素监控作为细胞培养的常规标准。,鲎试剂凝胶半定量法检测（参考2010年版中国药典）,4.5，内毒素检测方法,鲎试剂：鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素激活的凝固酶原（Proclotting enzyme）和凝固蛋白原（Coagulogen）。在适宜的条件下（温度，pH值及无干扰物质），细菌内毒素激活鲎试剂中的凝固酶原，使鲎试剂产生凝集反应形成凝胶。凝胶
12、法鲎试剂是根据反应所形成凝胶的程度来检测样品内内毒素的含量。,5，细胞间交叉污染,Hela细胞是第一株源细胞系。1952年建系以来，现在世界上已建有几千株细胞系，为我们的生物医药事业提供研究材料。但是随之而来的细胞间交叉污染以及细胞系错认现象必须得到重视。,细胞间交叉污染,http:/iclac.org/databases/cross-contaminations (International Cell Line Authentication Committee, ICLAC),超过400种细胞系已被鉴定为错认的细胞系,防止细胞交叉污染 （1）在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好
13、做上标记便于辨别。并严格按顺序进行操作，避免一起进行操作时易发生混乱。 （2）在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。 （3）所有细胞一旦购置，或从别处引入，或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之，重新复苏留种细胞进行培养。,每一株细胞都有独特的来源。因此，对于有疑问的的细胞株，可进行同工酶或STR(short tandem repeat，短片段重复序列)检测进行身份鉴定。STR广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性，它们一般由2-6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性
14、。对于一个特定的个体，染色体上某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一位置处的重复次数可能不同，这就构成了人群中这些重复序列的多态性。由于人类基因组中这种重复序列非常多，通过对这种多态性的检测，就可以明确区分个体与个体的不同，确定父母子的亲缘关系。 近年来，大量研究表明STR基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的最有效和准确的方法之一，STR基因分型应用于细胞鉴定已被ATCC等机构强烈推荐。,细胞交叉污染的检测,国内尚无这方面的报导,任重而道远，吾将上下而求索,谢 谢 ！,我们的地址：上海市徐汇区岳阳路320号 细胞库/干细胞库 网址： 联系方式：021-54921358 tygu 顾老师,
