《第六章-基因表达调控资料》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第六章-基因表达调控资料（39页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、操纵子的实验、种类及生物学意义 （Operon, species and biological significance of the experiment）,本章主要内容 基本概念与原理 原核生物基因转录调控 操纵子的种类,一、操纵子的概念 是由功能上相关联的多个编码序列（2个以上）及其上游的调控序列（包括操纵序列、启动序列和调节序列）等成簇串联在一起，构成的一个转录协调单位。 原理：当乳糖存在时，该酶分解乳糖。当乳糖不存在时，阻遏基因产生阻遏蛋白，结合到操纵子基因上。这种结合阻挡了结构基因的表达，使不产生分解乳糖的酶。但是，当环境中存在乳糖时，乳糖分子结合到阻遏蛋白的底物上，阻止了阻遏蛋白
2、和操纵基因的结合。操纵基因现在自由了，它将不阻挡结构基因表达。 1940年，Jacques Monod开始研究E.coli 进行乳糖代谢的一些特征研究，观察到乳糖和其他半乳糖苷可以诱导-半乳糖苷酶的产生。他和MelvinCohn用抗-半乳糖苷酶抗体检测酶蛋白，发现诱导后酶量增加。 进一步研究发现事情更复杂。一些神秘的突变株“cryptic mutants”能产生-半乳糖苷酶，但是却不能在以乳糖为碳源的培养基中生长。这是什么原因呢?,为了回答这个问题，他们用放射性标记的半乳糖苷进行研究。发现野生型菌在乳糖诱导后会摄取半乳糖苷，而这种突变型菌不能。 -Lactose +Lactose Wild s
3、train - + Cryptic mutant - - 这个实验结果有什么提示呢？ 1）在野生型菌中，有一种物质与-半乳糖苷酶一起被诱导，它负责输送半乳糖苷进入细胞。 2）突变株中，这种物质的基因被破坏。 Monod和同事努力分离纯化得到了半乳糖苷透过酶。在这个过程中，他们还分离到了另一个蛋白：半乳糖苷转乙酰酶，该酶与-半乳糖苷酶和半乳糖苷透过酶一起被诱导。 这样，到了50年代末，Monod已经知道有三种酶共同被半乳糖苷诱导。他们也发现了一些组成型突变株，不需要诱导就可以产生这三种酶。Monod认识到用遗传学分析可以加快实验进展，所以与同在Pasteur Institute工作的Franco
4、is Jacob开展了合作研究。,5,阻遏的机制 Barbara Krummel and Michael Chamberlin提出一种解释：R阻断了起始转录复合物向延伸状态的转变。换句话说，R把RNAP困在起始状态，只能合成很短的转录体。 Jookyung Lee and Alex Goldfarb为这一解释提供了实验证据。应用了run-off转录方法，使用一旦123bp DNA（含lac控制区和lacZ基因的起始部分）。先将R与DNA一起孵育10min，让R-O结合。再加RNAP，20min后（让开放型启动子复合物形成）加heparin。Heparin能与游离的RNAP或与DNA结合不紧密的
5、RNAP结合，抑制RNAP与启动子结合。然后加入RNAP反应的其他成分，但不包括CTP。5min后，加入-32P-CTP及IPTG，并设立不加IPTG对照。反应10min后，通过电泳观察是否发生run-off转录。 实验结果显示，确实观察到了转录题。因此，R不能抑制RNAP与laP之间的紧密结合。 实际上lac操纵子有3个operator。除了主要的O1，还有两个辅助的O，一个在上游，一个在下游，都与阻遏作用有关，但O1起主要作用。两个O之间可以通过R相互作用。 Lac操纵子的正调控 当E.coli在含葡萄糖和乳糖的混合碳源培养基中生长时，菌体首先利用葡萄糖，仅当葡萄糖消耗完后才利用乳糖。在葡
6、萄糖存在时，即使无阻遏物存在（lacI-），lac基因也不表达。 进一步研究表明，葡萄糖对lac基因表达的抑制是间接的，是葡萄糖的某些代谢产物抑制了lac基因表达，因此这种效应被称为代谢物阻遏效应（catabolite repression）。,二、诱导和阻遏表达 诱导表达 在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为可诱导基因。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为诱导(induction)。 阻遏表达 如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是可阻遏基因。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏(repression)。,三、协调表达 协调表达 在一定机制控制
7、下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、共同表达，即为协调表达(coordinate expression)，这种调节称为协调调节(coordinate regulation)。,四、基因表达调控的生物学意义,（一）适应环境变化、维持细胞增殖、分化 （二）维持个体生长、发育,五、基因转录激活调节基本要素 （一） 特异DNA序列 （二） 调节蛋白 （三） RNA聚合酶,基因激活,转录起始,原核生物的特异DNA序列 原核生物的基因表达与调控是通过操纵子机制实现的。,（一）特异DNA序列,操纵子 调节序列 启动序列 操纵序列 编码序列 表达 转录,I,CAP,P,O,Z,Y,A
8、,阻遏蛋白 结合部位,RNA聚合酶 结合部位,编码序列 规定蛋白质结构，又称结构基因； 多顺反子mRNA 由多个结构基因串联在一起，受同一个启动序列调控，转录生成一个mRNA, 翻译生成多个蛋白质,称此为多顺反子mRNA.,多顺反子mRNA,阻遏蛋白,1）启动序列(启动子)： 在距离转录起始点10区和35区往往含有一些重要的保守序列（共有序列）。 10区：含TATAAT序列，又称TA盒子。 35区：含TTGACA序列。,RNA聚合酶结合部位 决定转录起始点,13,共有序列(consensus sequence) 决定启动序列的转录活性大小。,某些特异因子（蛋白质）决定RNA聚合酶对一个或一套启
9、动序列的特异性识别和结合能力。,14,2 操纵序列 阻遏蛋白(repressor)的结合位点,当操纵序列结合有阻遏蛋白时，会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或是RNA聚合酶不能沿DNA向前移动 ，阻碍转录。,15,3) 其他调节序列、调节蛋白,例如,激活蛋白(activator)可结合启动序列邻近的DNA序列，促进RNA聚合酶与启动序列的结合，增强RNA聚合酶活性。,有些基因在没有激活蛋白存在时，RNA聚合酶很少或完全不能结合启动序列。,真核生物的特异DNA序列 真核生物基因组中含有可以调控自身基因表达活性的特异DNA序列，称为顺式调控元件。 顺式调控元件能够被转录调节蛋白特异识别和结合，从
10、而影响基因表达活性。 启动子(promoter) 顺式作用元件又分 增强子(enhancer) 沉默子(silencer),（1）启动子 是RNA聚合酶结合位点及其周围的一组转录调控组件（包括转录起始点以及典型的TATA盒）。 （2）增强子 是增强启动子转录活性的DNA序列，并决定组织特异性表达。 （3）沉默子 能够对基因转录起阻遏作用的DNA片段，属于负性调控元件。,18,不同真核生物的顺式作用元件中也会发现一些共有序列 ，如TATA盒、CAAT盒等，这些共有序列是RNA聚合酶或特异转录因子的结合位点。,（二）调节蛋白,原核生物的调节蛋白（3类） 特异因子 决定RNA聚合酶对启动序列的特异识
11、别和结合能力； (RNA聚合酶的因子) 阻遏蛋白 通过与操纵序列结合，阻遏基因转录； （由调节基因表达的阻遏蛋白） 激活蛋白 与启动子上游DNA序列结合，促进RNA聚合酶与启动序列 结合，促进基因转录。（CAP分解代谢物基因活化蛋白）,2. 真核生物的调节蛋白 反式作用因子 能直接或间接与顺式作用元件相互作用，进而调控基因转录的一类调节蛋白，统称为反式作用因子。,还有蛋白质因子可特异识别、结合自身基因的调节序列，调节自身基因的表达，称顺式作用。,这种调节作用称为反式作用。,22,反式调节,顺式调节,反式作用因子与顺式作用元件之间的特异识别及结合。通常是非共价结合，被识别的DNA结合位点通常呈对
12、称、或不完全对称结构。,绝大多数调节蛋白质结合DNA前，需通过蛋白质-蛋白质相互作用，形成二聚体(dimer)或多聚体(polymer)。,24,反式作用因子按其功能不同，常有以下三类： 基本转录因子 转录调节因子：DNA-蛋白质 共调节因子：蛋白质-蛋白质,(2) 转录调节因子 这类调节蛋白能识别并结合转录起始点的上游激活序列和远端的增强子元件，通过DNA蛋白质相互作用而调节转录活性。 起激活转录作用转录激活因子； 阻遏转录作用转录阻遏因子。 （3） 共调节因子 首先与转录因子或转录调节因子发生蛋白蛋白相互作用，进而影响它们的分子构象，以调节转录活性。 如果与转录激活因子有协同作用共激活因子
13、； 与转录阻遏因子有协同作用共阻遏因子。,(三) RNA聚合酶 1. 启动子与RNA聚合酶活性 启动子核苷酸序列影响与RNA聚合酶的亲和力。 2. 调节蛋白与RNA聚合酶的活性 调节蛋白通过DNA-蛋白质相互作用、蛋白质-蛋白 质相互作用影响RNA酶活性。,六、基因表达的多级调控,基因结构活化 转录水平 转录起始 转录后加工 转录后水平 转录产物的转运 翻译调控 翻译水平 翻译后加工,第二节 原核生物基因转录调控 一、乳糖操纵子调节机制,控制区,信息区,结构基因(S),操纵序列（O）,启动序列（P）,调节基因（I）,CPA,一、乳糖操纵子调节机制,（一）乳糖操纵子(lac operon)的结构
14、,没有乳糖存在时,（二）阻遏蛋白的负性调节,有乳糖存在时,无葡萄糖，cAMP浓度高时,有葡萄糖，cAMP浓度低时,（三）CAP的正性调节,当培养基中乳糖浓度降低而葡萄糖浓度升高时,细胞中cAMP浓度降低,缺乏乳糖与阻遏蛋白结合,CAP失活,阻抑蛋白与操纵基因结合,CAP及RNA聚合酶不能与启动基因结合,基因转录被阻遏,阻遏蛋白的负性调节,当培养基中乳糖浓度升高而葡萄糖浓度降低时,细胞中cAMP浓度升高,乳糖作为诱导剂与阻抑蛋白结合,cAMP与CAP结合并使之激活,促使阻抑蛋白与操纵基因分离,CAP与启动基因结合并促使 RNA聚合酶与启动基因结合,基因转录激活,CAP的正性调节,35,（四）协调
15、调节,当阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用；,如无CAP存在，即使无阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。,单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源； 若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。,葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。,36,操纵子的分类,操纵子主要见于原核生物的转录调控，分为乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、组氨酸操纵子、色氨酸操纵子等。 阿拉伯糖操纵子 ara operon 阿拉伯糖操纵子是指令合成糖分解代谢所需酶系的操纵子，它具有正、负调节的功能。,37,结构和功能 阿拉伯糖的代谢是由araB、araA和a
16、raD基因所编码的三种酶的催化的。,其特点是：（1）AraC蛋白是双功能的，单纯的C蛋白结于araO1(-100-144)，起到阻遏的作用；当C蛋白和诱导物Ara结合形成的复合体是Cind， 即诱导型的C蛋白，它结合于araI区（-40-78）使RNA Pol结合于PBAD位点（+140），转录B、A、D三个基因；（2）C蛋白结合araO1时也反馈性地阻遏了其本身的表达；（3）C蛋白的两种状态（Cind和Crep）功能不同，结合的位点也不同Cind结合于araI；Crep可结合于araO1和araO2；（4）ara操纵子的C蛋白还可以调节分散的基因araE和F，因此此转录单位也称调节子（regulo
