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1、儿童医院儿科医学研究所 李梨平,标记免疫检测技术新进展,标记免疫技术的发展 化学发光系统及其原理 免疫检测项目进展,放免,酶免 荧光免疫 化学发光,电化学发光,1960S,197080S,2000S,1，抗体技术的革命，从使用多克隆抗体向使用单克隆抗体转变 2，从手工操作向全自动分析仪的转变 3，从液相放射免疫技术向均相和固相免疫分析技术的转变,1959年Berson和Yalow建立了放射免疫分析方法（RIA），大大提高了免疫测定的敏感度，这种标记免疫测定开拓了医学检验的新领域 。,缺点 半衰期短，试剂货架期不长。 标记物不断变化，试剂批间、批内变化大，标准曲线不能保存 反应时间长，操作步骤很
2、难自动化。 使用放射性核素，对人体有一定的危害性。 分析的限度为 10 mol/ml 或 10 g/ml。,在一定时期内曾被采用，正在被逐步取代,放射免疫测定法,1971年Engvall和Perlman建立了固相酶免疫测定方法（ELISA），这种非放射标记免疫测定在临床检验，特别是感染性疾病的诊断中取得了广泛应用。,酶免疫测定法,缺点 试剂制备困难。 操作步骤复杂，耗时长。 影响因素多，质量控制难以保证。 最后测定的是颜色的光密度，其精密度和敏感性不如发光免疫技术。,各实验室操作不规范，质量难以保证。有学者认为ELISA技术已逐步走向退化，可能会逐步退出临床实验室。,发光是指分子或原子中的电子
3、吸收能量后，由基态跃迁到激发态，然后再返回到基态，并释放光子的过程。 化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发光 化学发光免疫分析是将化学发光与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的标记免疫分析技术，分为直接化学发光免疫分析，化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析。,化学发光免疫分析,按发光剂不同分为 1.发光酶免疫测定技术（CLEIA） 2.化学发光免疫测定技术(CLIA) 3.电化学发光免疫测定技术(ECLIA) immunoassay,化学发光免疫分析目前分类,化学发光反应参与的免疫测定分为二种类型 第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物，通过发光反应增强测定的敏感性
4、第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物，直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。,属于酶免疫测定的一种。只是最后一步酶反应所用底物为发光剂，通过发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。 技术类型 根据酶促反应底物不同可分为 1.荧光酶免疫测定技术 2.化学发光酶免疫测定技术 根据免疫学反应模式分 1.双抗体夹心法和双抗原夹心法 2.固相抗原竞争法：,发光酶免疫测定技术（CLEIA）,用化学发光剂直接标记抗原或抗体,与待测标本中相应Ab或Ag、磁颗粒性的Ag或Ab反应，通过磁场把结合状态（沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发光反应，通过对发光强度的检测进行
5、定量或定性检测 。 技术类型 1.分离方法 常用磁颗粒分离技术 2.免疫学反应模式 同酶发光免疫测定技术 3.不同只是相应标记物是吖啶酯而不是酶,化学发光免疫测定技术（CLIA）,用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。,直接化学发光免疫分析,直接化学发光的机理,发光,Y,Y,Y,磁微粒
6、,被测抗原,+,抗体,+,带丫啶酯标记物抗体,冲洗后,- 夹心法,（1） 加入H2O2 （pH10）,（2） 加入碱 （pH10）,磁微粒模式图,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,特点 抗原和抗体结合与未结合部分易分离 缩短抗原抗体结合反应时间，使测定时间减 少，并降低交叉污染率。,磁微粒技术,化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体
7、复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。,化学发光酶免疫分析,该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。,辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析,辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图,该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，
8、形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。,碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析,碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图,电化学发光免疫技术,电化学发光免疫测定法（ECLIA）发展于 1996年，它 在发光反应中加入了电化学反应，是继放射免疫、酶免 疫、化学发光免疫测定之后的新一代标记免疫测定技术， 是电化学和免疫测定相结合的产物。,世界公认的 最先进 的临床免疫检测技术,1996年德国宝灵曼公司推出Elecsys 2010系统 世界上第一台 应用电化学发光技术的全自动免疫分析仪 1998年罗氏公司收购宝灵曼公司 2001年罗
9、氏推出电化学发光免疫模块E 170 罗氏是全球唯一 应用电化学发光免疫技术制造仪器的厂商 2006年罗氏推出电化学发光免疫模块e601 2007年罗氏推出电化学发光免疫模块e411,ECL 2010 disk,E170,ECL 2010 rack,e601,Elecsys系列全自动免疫分析仪,e411 disk,e411 rack,是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用化学发光剂三联吡啶钌Ru(bpy)32+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量。 技术类型 1.分离方法 常用磁颗粒分离技术 2.免疫学反应模式 同
10、酶发光免疫测定技术 3.相应标记物是三联吡啶钌而不是酶,电化学发光免疫测定技术（ECLIA）,电化学发光原理,底物：三联吡啶钌Ru(bpy)2+3 N羟基琥珀酰胺酯(NHS) 三丙胺(TPA),在电极阳极表面，以上两种电化学活性物质同时失去电子发生氧化反应，2价的Ru(bpy)2+3 标记物被氧化成3价的Ru(bpy)3+3 的标记物，TPA被氧化成阳离子自由基TPA+* ， TPA+* 很不稳定，自发地失去一个质子而形成自由基TPA* ，其为强还原剂，将一个电子给3价的Ru(bpy)3+3 ，使其成为激发态的Ru(bpy)2+3 ，而TPA自身被氧化成氧化产物。激发态的Ru(bpy)2+3衰
11、减时发射一个波长620nm的光子，重新形成基态的Ru(bpy)2+3 。这一过程在电极表面周而复始进行，产生许多光子。使得光信号增强。,电化学发光反应的原理 三联吡啶钌和三丙胺在电极表面发生的电化学发光反应,Sandwich Principle 双抗夹心法, large molecular weight antigens are measured directly proportional measurement, means: low signal = low concentration high signal = high concentration e.g. TSH, CA 15-3 I
12、I assays,双抗夹心法 & 桥联免疫法,Competitive Principle 竞争法, small molecular weight antigens are measured indirectly proportional measurement, means: high signal = low concentration low signal = high concentration e.g. T4, Folate II assays,竞争法,电化学发光免疫系统核心原理,电化学发光,磁性微粒子固相,亲和素- 生物素间接包被,流动池检测系统,简单试剂管理，先进的定标概念,直径最
13、小 2.8um 表面积大而均一 磁性微粒子呈悬浮状态 使异相反应变成类均相反应 加快反应速度 提高反应灵敏度,磁性微粒子固相载体的优点,专利的链霉亲和素-生物素包被技术,适用于包被各种化合物，如多肽、脂多糖等。,亲和素包被微粒子高效、均一、稳定、通用。,链霉亲和素- 生物素间接包被的优势,生物素结合物与标本液相反应。,生物素- 亲和素反应亲和力强。,由磁铁将结合标记Ag-Ab复合物的磁性微粒（结合相）吸附于电极上，游离相被缓冲液冲走； 电极表面的电化学发光的信号检测完成后，磁铁移走并使用系统清洁液冲走电极表面的结合标记Ag-Ab复合物的磁性微粒子； 实现了结合相与游离相的全自动分离,流动池检测
14、系统,电化学发光免疫分析示意图,灵敏度高 这是CLIA关键的优越性，其灵敏度可达10-16/-21mol/L（RIA为10-12mol/L）。又如化学发光底物（如AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏5105倍。,化学发光免疫分析的优点,几种标记免疫技术灵敏度的比较,酶标,荧光,放免,发光,灵敏度(mol/L),10-18 10-15 10-12 10-9,线性范围宽 发光强度在46个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶免疫分析吸光度（OD值）为2.0的范围相比，优势明显。也优于放射免疫分析技术。,几种标记免疫技术线性范围的比较,酶标,荧光,放免,发光,线性范围,1
15、05 104 103 102,安全性好 试剂无放射性危害，环保、安全且易保存,几种标记免疫试剂的有效期比较,酶标,荧光,放免,发光,有效期（月）,18 15 12 9 6 3 0,InhA发现与应用历史,1932年McCullagh发现非类固醇来源的抑制物质 1966年HCG和LH检测的实现推动了Inh调节作用的理念 1975年Sherman & Korenman 观察到卵巢卵泡液中存在抑制素样物质,1985年从牛和猪的卵泡液中分离出Inh 1986年基因克隆和重组技术进一步分离出Inh，并大批量生产,上世纪90年代InhA 欧美等国开始应用于临床筛查唐氏综合征，以及先兆子痫等生殖健康领域的研
16、究 DSL公司研发了ELISA方法试剂用于唐氏综合征筛查获得了美国FDA许可,InhA在欧美国家临床得到广泛应用，并列入主要国家指南标准，证明其临床价值 2005年贝克曼库尔特收购DSL公司后，拥有独家专利。实现InhA检测自动化，进一步优化其临床应用的可行性和便利性 2012年4月贝克曼库尔特完成在中国SFDA注册，填补国内InhA产筛应用及其他临床应用的空白,40,抑制素属于TGF- 超家族成员,Padmanaban Suresh, et al., Endocrine Journal, 2011,Inhibin-A = + A 32kDa 糖蛋白 男性：睾丸支持细胞、塞尔托利细胞 女性：卵巢颗粒细胞、黄体细胞、子宫内膜、胎盘 负反馈抑制垂体FSH的分泌,抑制素A的结构和合成,de Kretser DM, et al., Hum Reprod Update, 2002,Company Confidential,43,抑制素A参与调节女性卵泡
