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1、灵芝多糖提取方法的研究天津市医药职工大学 05中制大专8班 季君摘要：将各种中药处理新技术应用于灵芝多糖的提取研究，并筛选出最佳提取工艺条件。通过对回流提取法、微波提取法、超声提取法、酶解-回流提取法4种方法进行对比，得出灵芝多糖提取的最佳方法：酶解-回流提取法。再蚁媒用量，料液比，酶解温度，提取温度等对酶解-回流提取法进行单因素试验，初步确定各因素的最佳范围。通过进一步的正交试验，得出最佳工艺条件为以水为溶剂，料液比112，20 l/g(相对灵芝干重)植物复合水解酶，50酶解1.5 h，100提取2次。结论：灵芝多糖提取的最佳方法是酶解-回流提取法，而且采用酶解辅助提取灵芝多糖，可以明显提高
2、多糖的提取率。 关键词：灵芝；多糖；提取；酶解前言：灵芝多糖是由10个分子以上的一种或多种单糖连接而成的大分子化合物1是一切生命机体必不可少的成分，具有多种生物活性。有文献2报道灵芝多糖对机体具有令人满意的免疫增强作用。还有报道显示，灵芝多糖对异常增高的血糖有降低作用，而且可以减少放射性物质对机体的损害，促进机体核酸和蛋白质的合成。据文献3报道，生物酶解技术、超临界流体萃取技术、微波技术、超声波技术等已广泛应用于中药有效成分的提取工艺中。目前，关于灵芝多糖提取工艺研究的文献报道较少，张仁权等4报道了灵芝多糖的提取及含量测定，但并没有对灵芝多糖提取工艺进行优化筛选。本次将生物酶解技术、微波技术、
3、超声波技术应用于灵芝多糖的提取工艺研究，通过对4种提取方法的综合比较，确定最佳提取方法，然后对其进行工艺优化筛选，得出最佳提取工艺参数，可为灵芝多糖的结构表征、活性功能实验以及灵芝多糖产品的工业化生产奠定基础。一、灵芝多糖成分和结构：1灵芝多糖是灵芝叶片中主要功能性成分。灵芝叶中的多糖由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖组成，其相对含量甘露糖为60.73，半乳16.42，阿拉伯糖5.45，鼠李糖4.42葡萄糖9.16，木糖3.83。 用两万分子量以上的灵芝多糖进行免疫功能等项药理实验，在5mg/kg的浓度下，具有促进免疫功能的作用。从灵芝叶中分离得到三种多糖：A60b，A90a，A
4、90b，分子量分别是12000，47000和12000。A60b的结构为-(14)连接的甘露聚糖，在2,3或6位上部分乙酰化。A90b的结构为-(14)结构的直链俯萄-甘露聚糖。实验证明Aloe china中灵芝多糖的含量较高。另外，对Aloe Arborescens与Aloe china的碳水化合物的组成进行比较分析，Aloe china中除了多含有葡萄糖醛酸外，和Aloe Arborescens一样均含有可溶性糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和微量木糖。两种灵芝多糖的组成Aloe Arborescens是以半乳糖为主，还有甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖组成的中性杂多糖；而Aloe vear是以甘露糖
5、为主，其次为半乳糖、葡萄糖、和阿拉伯糖组成的酸性杂多糖。南斯拉夫科学家对Aloe Arborescens中酸性多糖进行了较为深入的研究，发现它是由D-葡萄糖和D-葡萄糖醛酸以9：1分子比组成的分枝多糖。也有人指出，Aloe Arborescens中的主要多糖为部分乙酰化的葡萄-甘露聚糖，其分子量为1,5000左右，并指出这种多糖对S-180有抑制作用。Gowda等人报道Aloe vear中至少存在四种多糖，都是不同程度乙酰化的葡萄-甘露聚糖。对分离得到的免疫调节活性多糖进行了细致的结构分析，结果表明此类多糖的主链主要是由Man:Glc:Gal:GalA:Fuc:Ara:Xyl以120：9：6：
6、3：2：2：1的比例组成的以及痕量的4,6-Galp和3,6-Galp；水解后得到的产物主要是短链的低聚糖和一抗酸片断的混合物。总之，科学家试图通过灵芝多糖结构的精细研究揭示其结构与功能之间的构效关系。2、灵芝叶的新鲜汁液含灵芝大黄素、灵芝大黄素苷、异灵芝大黄素苷、对香豆酸、少量蛋白质及许多草酸钙的结晶。各种灵芝属植物皆含蒽醌衍化物。灵芝大黄素(Aloeemodin),灵芝大黄素苷(Aloin,barbaloin),为淡黄色结晶性苷，灵芝泻素蒽酚或灵芝泻素蒽酮，灵芝大黄素苷的异构体异灵芝大黄素苷(Isobarbaloin),高塔尔灵芝素(Homonataloin)，蒽酚(Anthranol)
7、大黄酚(Chrysophanol),大黄酚葡萄糖苷(Chrysophanolglucoside)等蒽类及其甙类，以及榭皮素(Quercetin),莰非醇(Campherenol),芦丁(Rutin)等黄酮类和亦含有精氨酸，天冬酰胺，谷氨酸等人体必需的八种氨基酸，以及胆固醇(Cholesterol),菜油醇(Fructose),谷醇(Sitoterol).还含有酸(Capricacid),月桂酸(Lauricacid),肉豆蔻酸(Myristicacid),油酸(Oleicacid),亚油酸(Linoleicacid),棕榈油酸(Palmitoleicacid)，琥珀酸(Succinicacid
8、),乳酸(Lacticacid)等脂肪酸类物质，以及钾，钠，铜，锌，铬等二十多种无机元素和维生素等物质。灵芝大黄素(Rhabarberone)异名：灵芝泻素结构式：物理性状：橙色针状结晶(甲苯)，熔点223224度，易溶于热乙醇，在乙醚及苯中显黄色，氨水及硫酸中显绯红色。植物来源：蓼科植物掌叶大黄RheumPalmatumL.根茎，药用大黄R.officinaleBaill.根茎,巴天酸模RumexPatientiaL.根,齿果酸模R.dentatusL.叶,豆科植物山扁豆CassiamimosoidesL.根,决明C.toraL.种子,望江南C.occidentalisL.种子,鼠李科植物鼠
9、李RhamnusdavuricaPall.果实灵芝大黄素甙(Aloin)异名:灵芝甙,灵芝素(Barbaloin)结构式：物理性状:柠檬黄结晶,熔点148149度(乙醇),一水合物熔点7080度,略带沉香气味,味苦,易溶于吡啶,溶于冰醋酸,甲酸,丙酮,醋酸甲酯,以及乙醇等.植物来源：百合科植物库拉索灵芝Aloevera.L.叶.灵芝宁(Aloenin)异名:Aloearbonaside结构式：物理性状:一水合物熔点145147度,无水物熔点204205度(氯仿-甲醚),植物来源:百合科植物斑纹灵芝AloeveraL.var.chinensis(Haw.)Berger叶3、灵芝中含有纤维素酶、缓
10、激肽酶、过氧化氢酶、淀粉酶、蒜氨酸酶、超氧化物歧化酶（SOD）、木糖酶以及脂酶等等，其中不乏对人类大有裨益的酶，灵芝中的酶类、蒽醌类和多糖类物质是其生物体中主要活性成分，加之维生素、矿物质元素构成了一个鲜活的整体，然而我们对这个复杂的生物体本身知之甚少。在初级原料加工中，为了产品性状，蒽醌类物质被去除，酶被灭活，甚至在其中加入化学防腐剂，最终仍旧导致产品较初始原料生物活性大大下降。4 灵芝素具有抑制胶原酶和金属蛋白酶活性的作用，另有研究表明存在少量灵芝素不以游离状态存在，而是在新鲜凝胶中共轭成配糖体，当酶作用于配糖体时，灵芝素才能被游离出来。是不是灵芝中的多糖、酶、灵芝素之间存在相互制约的关系
11、呢？他们在灵芝植株内是怎样的一种平衡关系？灵芝是怎样做到多糖成分不被纤维素酶过度的分解的？也许我们不应该将这几大类活性物质分开进行独立的研究，或许我们更应该从生化的角度进一步认识它们之间的相互关系，只有清楚地掌握了他们的关系，我们才能利用灵芝的神奇功效造福于人类，找到更加合理的生产工艺，开发出更加天然的稳定的产品。二方法 1灵芝多糖不同提取方法 基本工艺流程提取工艺为原料过筛乙醇回流水提取过滤滤液离心回流法称取灵芝样品5 g，加80%乙醇50 ml，90水浴回流1 h，重复1次，过滤，滤渣挥干乙醇，加75ml蒸馏水，浸泡1 h，100水浴回流1 h，重复提取2次，合并提取液，离心，取上清液定容
12、至250 ml，测定吸光度，制备灵芝粗多糖。微波法5，微波重复提取3次（每次加热至沸腾，静置1 min，再加热至沸腾，反复5次），合并提取液，离心，取上清液定容至250 ml，测定吸光度，制备灵芝粗多糖。 超声法6，放进超声波发生器，超声提取30 min，再重复提取2次，合并提取液，离心，取上清液定容至250 ml，测定吸光度，制备灵芝粗多糖。 酶解-回流法7，加0.1 ml复合酶，55酶处理1.5 h，然后100水浴回流提取1 h，重复提取两次，合并提取液，离心，取上清液定容至250 ml，测定吸光度，制备灵芝粗多糖。 2灵芝多糖的含量测定及制备 提取液多糖含量测定用蒽酮-硫酸法测定8。 灵
13、芝粗多糖的制备取测定过吸光度的灵芝提取液，真空浓缩至50 ml，浓缩液中加入无水乙醇至醇浓度达到70%，于4冰箱中过夜，再离心分离，滤渣放进烘箱中（50）干燥，称重，计算得率。 灵芝多糖复水性实验精密称取105干燥至恒重的灵芝多糖10 mg，置于小烧杯中，加蒸馏水溶解，然后转移至50 ml容量瓶中并稀释到刻度，配成0.2 mg/ml的灵芝多糖溶液，按2.2.1节含量测定方法测定吸光度A。 3酶解-回流法工艺优化 酶解-回流法提取条件单因素实验在酶解-回流提取灵芝多糖时，影响其提取率的主要因素有9：提取温度、酶用量、料液比、酶解温度、提取次数。通过单因素实验确定它们作用的合适范围，为酶解-回流法
14、提取灵芝多糖正交实验提供数据。 酶解-回流法提取条件的正交设计及实验，根据单因素试验结果，确定各正交设计因子的水平，对酶解-回流法提取工艺进行研究，确定灵芝多糖酶解-回流提取法的最佳工艺参数。 酶解-回流法最佳工艺放大实验准确称取20g灵芝样品3份，在2.3.2节优化的工艺条件下，即酶解温度为50，料液比为112，酶用量为20 l/g，提取，离心，定容，测定吸光度A值，计算灵芝多糖提取率。 结果 1灵芝多糖不同提取方法结果比较分别选用两份样品进行灵芝多糖不同提取方法的比较试验，每组实验做3个平行样，各组提取液吸光度测定结果的RSD值均小于3%，粗多糖重测定结果的RSD值均小于5%，复溶吸光度的
15、RSD值均小于3%。4种提取方法综合评价：根据各指标在提取工艺选择中的主次地位，给予不同的加权系数，以标准化后的值加权后求和，即得综合评价Y值，其中Y=吸光度3粗多糖重4复溶吸光度3。 对4种提取方法的实验结果进行标准化处理，以消除各指标的单位和量纲的不同，以及各指标变量范围相差悬殊所造成的影响，同时根据各指标在工艺选择中的主次，确定不同的加权系数，以标准化处理加权求和后的Y值为综合指标，评判4种提取方法的优劣，较各评价指标直接相加更加科学、合理。 由以上结果可以看出，如果采用两个灵芝样品，以提取液吸光度、粗多糖重、粗多糖复溶吸光度为衡量标准综合考虑，则酶解-回流法的综合评价指标回流提取法微波
16、提取法超声提取法。可见，经酶解处理后可明显提高灵芝多糖的提取率。由于植物提取过程中的屏障-细胞壁被破坏，因而酶法提取有利于提高有效成分的提取率。本文所采用的酶解-回流法，其灵芝多糖提取效果优于传统提取方法。王士刚等10报道，采用纤维素酶和菠萝蛋白酶，对香菇及香菇柄的提取进行酶解处理，可以提高香菇多糖的提取率。于淑娟等11人对超声波酶法提取灵芝多糖的机理进行了研究，结果表明，该法具有水解效率高，产品质量好等优点，同时还能缩短提取周期，并使反应条件更加温和。 本文通过对4种提取方法的对比研究，经综合考虑最终确定酶解-回流法为最佳提取方法，灵芝多糖酶法提取的文献未见报道，因此，需对酶解-回流法的工艺条件进一
